الطرق الوراثية الجزيئية لتشخيص الأمراض الوراثية

تُستخدم أساليب تقنية الحمض النووي لتحديد موقع جين متحور في كروموسوم معين، وهو المسؤول عن أصل بعض أشكال الأمراض الوراثية. بما أن الجين جزء من الحمض النووي، وأن طفرة الجين هي تلف في البنية الأساسية للحمض النووي (الطفرة هي جميع التغييرات في تسلسل الحمض النووي، بغض النظر عن موقعها وتأثيرها على قابلية الفرد للحياة)، فمن خلال فحص تحضيرات كروموسومات الطور الاستوائي لمريض مصاب بمرض وراثي، يُمكن تحديد موقع الجين المرضي. تتيح الأساليب الوراثية الجزيئية فرصًا لتشخيص الأمراض على مستوى بنية الحمض النووي المتغيرة، فهي تسمح لنا بتحديد موقع الاضطرابات الوراثية. ويمكن للأساليب الوراثية الجزيئية تحديد الطفرات المرتبطة باستبدال قاعدة واحدة فقط.

أهم مرحلة في تحديد الجينات هي عزلها. يمكن عزل الحمض النووي من أي نوع من الأنسجة والخلايا التي تحتوي على نوى. تشمل مراحل عزل الحمض النووي: التحلل السريع للخلايا، وإزالة أجزاء من العضيات والأغشية الخلوية بالطرد المركزي، والتدمير الأنزيمي للبروتينات واستخلاصها من المحلول باستخدام الفينول والكلوروفورم، وتركيز جزيئات الحمض النووي بالترسيب في الإيثانول.

في المختبرات الوراثية، يُعزل الحمض النووي (DNA) عادةً من كريات الدم البيضاء، حيث يُؤخذ من المريض 5-20 مل من الدم الوريدي في أنبوب اختبار معقم يحتوي على محلول مضاد للتخثر (هيبارين). بعد ذلك، تُفصل كريات الدم البيضاء وتُعالَج وفقًا للخطوات المذكورة أعلاه.

المرحلة التالية من تحضير المادة للبحث هي "تقطيع" الحمض النووي إلى شظايا في مناطق ذات تسلسل قاعدي محدد بدقة، ويتم ذلك باستخدام إنزيمات بكتيرية - نوكليازات القيد (إنزيمات القيد). تتعرف إنزيمات القيد على تسلسلات محددة من 4 إلى 6 نيوكليوتيدات، وفي حالات نادرة، من 8 إلى 12 نيوكليوتيدًا في جزيء الحمض النووي ثنائي السلسلة، وتقسمه إلى شظايا في مواقع هذه التسلسلات، تُسمى مواقع القيد. يُحدد عدد شظايا القيد الناتجة من الحمض النووي بتواتر ظهور مواقع القيد، بينما يُحدد حجم الشظايا بطبيعة توزيع هذه المواقع على طول جزيء الحمض النووي الأصلي. كلما زاد تواتر مواقع القيد، قصرت شظايا الحمض النووي بعد القيد. يُعرف حاليًا أكثر من 500 نوع مختلف من إنزيمات القيد ذات الأصل البكتيري، ولكل منها تسلسل نيوكليوتيدي خاص به. في المستقبل، يمكن استخدام مواقع القيد كعلامات جينية للحمض النووي. يمكن ترتيب شظايا الحمض النووي (DNA) المتكونة نتيجة التقييد حسب الطول باستخدام الرحلان الكهربائي في هلام الأغاروز أو بولي أكريلاميد، وبالتالي تحديد وزنها الجزيئي. عادةً، يتم تحديد الحمض النووي في الهلام عن طريق التلوين النوعي (عادةً بروميد الإيثيديوم) وفحص الهلام تحت الأشعة فوق البنفسجية. تُلوّن مواقع توطين الحمض النووي باللون الأحمر. ومع ذلك، عند معالجة الحمض النووي لدى البشر بواسطة عدة إنزيمات تقييد، تتشكل شظايا كثيرة بأطوال مختلفة بحيث لا يمكن فصلها بالرحلان الكهربائي، أي أنه لا يمكن تحديد شظايا الحمض النووي الفردية بصريًا على الرحلان الكهربائي (يتم الحصول على تلوين موحد على طول الهلام بالكامل). لذلك، لتحديد شظايا الحمض النووي المطلوبة في مثل هذا الهلام، تُستخدم طريقة التهجين باستخدام مجسات الحمض النووي المُعلّمة.

أي جزء أحادي السلسلة من الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبوزي (RNA) قادر على الارتباط (التهجين) بجزء مكمل، حيث يرتبط الجوانين دائمًا بالسيتوزين، والأدينين بالثايمين. وهكذا يتشكل جزيء مزدوج السلسلة. إذا تم وسم نسخة أحادية السلسلة من جين مستنسخ بعلامة مشعة، يتم الحصول على مسبار. يستطيع المسبار العثور على جزء مكمل من الحمض النووي، والذي يمكن التعرف عليه بسهولة باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي. يسمح المسبار المشع المضاف إلى مستحضر من الكروموسومات الممتدة بتحديد موقع الجين على كروموسوم محدد: باستخدام مسبار الحمض النووي، يمكن تحديد مناطق محددة أثناء اختبار ساوثرن. يحدث التهجين إذا احتوى جزء الحمض النووي الذي يتم اختباره على جين طبيعي. في حالة وجود تسلسل نيوكليوتيد غير طبيعي، أي أن هياكل الكروموسوم المقابلة تحتوي على جين متحور، فلن يحدث التهجين، مما يسمح بتحديد موقع الجين المرضي.

للحصول على مسابير الحمض النووي، تُستخدم طريقة استنساخ الجينات. يكمن جوهر هذه الطريقة في إدخال جزء من الحمض النووي يتوافق مع جين أو جزء منه في جسيم استنساخ، وهو عادةً بلازميد بكتيري (حمض نووي حلقي خارج الكروموسومات موجود في الخلايا البكتيرية ويحمل جينات مقاومة للمضادات الحيوية)، ثم تُضاعف البكتيريا التي تحمل البلازميد مع الجين البشري المُدرج. بفضل عمليات التركيب في البلازميد، يُمكن الحصول على مليارات النسخ من الجين البشري أو جزء منه.

ويتم بعد ذلك استخدام نسخ الحمض النووي الناتجة، والتي تم وضع علامة عليها باستخدام مادة مشعة أو فلوروكرومات، كمسبارات للبحث عن تسلسلات تكميلية بين مجموعة جزيئات الحمض النووي المدروسة.

يوجد حاليًا العديد من أنواع الطرق المختلفة التي تستخدم مجسات الحمض النووي لتشخيص الطفرات الجينية.

[ 1 ]، [ 2 ]، [ 3 ]، [ 4 ]، [ 5 ]، [ 6 ]، [ 7 ]