عمل تجريبي على زراعة الخلايا الكيراتينية الخيفية على ندوب مصطنعة من الفئران البيضاء

إن الرغبة في استخدام الإمكانات الخلوية والحاجة إلى إيجاد طرق فعالة جديدة لتحسين المظهر الجمالي للندبات أدت إلى فكرة محاولة دراسة إمكانية زرع الخلايا الكيراتينية على سطح الندبة.

لإثبات إمكانية استخدام زراعة الخلايا الكيراتينية لتحسين مظهر الندبات، أُجريت دراسة تجريبية على فئران مختبرية بيضاء، خُلقت لها أسطح ندبات. تم الحصول على نموذج ندبة الفأر نتيجة التئام جروح اصطناعية على الظهر وعلى طول العمود الفقري. قُطعت من الفئران قطع جلد متطابقة، أبعادها 2 × 3 سم. بعد شهرين ونصف من عملية "نمذجة الندبة"، خضعت الفئران لتقشير الجلد (إزالة الطبقات العليا من الندبة باستخدام مادة حرارية كاوية)، وزُرعت خلايا كيراتينية متماثلة، عُزلت من جلد صغار الفئران بعد يومين إلى أربعة أيام من الولادة.

تم عزل وزراعة خلايا البشرة للفئران في مختبر تقنيات الخلايا بمعهد علم الخلايا التابع للأكاديمية الروسية للعلوم باستخدام التكنولوجيا التالية.

غُسل الجلد بمحلول هانك الملحي المحتوي على 200 وحدة/مل من جنتاميسين، ثم قُطِّع إلى قطع صغيرة، بمساحة 0.2-0.5 سم² ^. حُضِّنت قطع الجلد في محلول ديسبيز 0.5% في محلول متوازن من ملح الفوسفات المنظم عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة. ثم نُقلت القطع إلى محلول دولبيكو الملحي المنظم من الفوسفات، وفُصلت البشرة عن الأدمة. حُضِّنت البشرة في محلول تريبسين 0.125% لمدة 10-15 دقيقة مع التقليب بسرعة 50 دورة في الدقيقة، وبعد ذلك أُوقِف عمل الإنزيم بإضافة 5% من مصل جنين البقر. استُخدم ثلث مُعلق الخلايا الناتج في شكله النقي لأحد خيارات الزراعة على الندوب، بينما زُرِع الثلث الثاني على أغلفة أفلام منزلية متوافقة حيويًا "بوليبور"، بينما زُرِع الثلث الثالث على أطباق بتري بدون ركيزة. تم إجراء عملية تقشير الجلد للندبات الناتجة في الفئران مع زرع خلايا البشرة للفئران عليها تحت التخدير الأثيري باستخدام الكي الحراري.

في المجموعة الأولى من الفئران، وبعد التقشير الجلدي، وُضعت قطع معقمة من قماش الكامبريك على سطح الندبة المصقول والمغسول بمحلول فسيولوجي والمجفف، ثم وُضع عليها معلق مهتز من خلايا البشرة الجرذانية الخيفية بتركيز 1.5 مليون خلية لكل مل (وفقًا لمعهد علم الخلايا). وُضعت قطع الكامبريك على الندبة المصقولة بحيث تستقر الخلايا على سطحها. ووُضعت ضمادة من عدة طبقات من الشاش فوقها، وخُيطت على حواف الندبة.

تم زرع جزء من معلق الخلايا الناتج في أطباق بتري على أفلام بوليبور معقمة مقطوعة على شكل الأطباق، والجزء الآخر - على أطباق بتري بدون فيلم. تم إجراء الزراعة في وسط FAD، المكون من خليط من DMEM ووسط F12 بنسبة 3:1. مع إضافة 10٪ من مصل الجنين البقري، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين (سيغما)، و 0.5 ميكروغرام / مل من هيميساكسينات الهيدروكورتيزون (سيغما). 10 ميكروغرام / مل من عامل نمو البشرة EGF (معهد علم الخلايا RAS، سانت بطرسبرغ). تم إجراء العملية على المجموعتين الثانية والثالثة من الفئران، 7 أفراد لكل منهما، بعد 6 أيام من الأولى. بحلول هذا الوقت، تكونت طبقات متعددة من معلق الخلايا الكيراتينية المزروعة في أطباق بتري، والتي تم زرعها في الفئران. زُرعت الخلايا الظهارية في المجموعة الثانية على غشاء رقيق، بينما زُرعت في المجموعة الثالثة طبقة متعددة الطبقات بدون ركيزة. بعد 7 أيام، زُرعت الطبقات متعددة الطبقات من الخلايا الكيراتينية الخيفية (MPALK)، المزروعة على أغشية "بوليبور"، كمزارع مباشرة على سطح الجرح. في الأعلى، ثُبّت الغشاء بضمادة شاش متعددة الطبقات، لتجنب تمزقه، وخُيّط على جلد الفئران.

قبل زرع الخلايا الكيراتينية في المجموعة الثالثة من الفئران المزروعة بدون ركيزة، فُصلت الخلايا الكظرية من قاع طبق بتري بمعالجتها بمادة ديسبيز، التي تتمتع بالقدرة على تعطيل الروابط الجلدية-البشرية بشكل انتقائي. عند العمل على طبقة متعددة الطبقات، يُعطل ديسبيز اتصال خلايا الطبقة القاعدية بقاع طبق بتري ويكون تأثيره على الوصلات بين الخلايا أقل بكثير، مما يُتيح "إزالة" الطبقة بالكامل. تم فصل طبقة الخلايا متعددة الطبقات باستخدام ديسبيز على النحو التالي. تم تصريف وسط النقل من أطباق بتري، وغُسلت طبقات الخلايا ثلاث مرات بوسط مغذي يحتوي على مضادات حيوية، وخاصةً جنتاميسين (0.2 ملغ/مل). مُلئت الطبقات متعددة الطبقات بمحلول ديسبيز بنسبة 0.125% ("سيجما") ووُضعت في منظم حرارة، حيث حُضنت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. إن ظهور حافة بيضاء متقشرة على طول محيط الطبقة يُعد مؤشرًا على بدء عملية انفصالها عن حواف وقاع طبق بتري. بعد دقائق قليلة من بدء عملية الفصل، تم تصريف محلول ديسباس، وغسل الطبقات الظهارية مرتين أو ثلاث مرات بالوسط. وُضعت قطعة من ضمادة الجروح المعقمة "ليتا-كولور" مقصوصة بحجم الكأس على سطح الطبقة البشروية، ثم أُلصقت بها الطبقة المنفصلة بواسطة ديسباس، والتي تم تقشيرها أيضًا من قاع الكأس باستخدام ملعقة. باستخدام ملقط للعين، تم نزع الطبقة مع طبقة منديل "ليتا-كولور" (روسيا) من قاع طبق بتري، ونُقلت بعناية إلى سطح الندبة المُجهز. تحتوي المناديل "Lita-color" على جنتاميسين وإكسولين (مستخلص الكولاجين)، والتي عند ترطيبها ببقايا وسط النمو ثم بمحلول فسيولوجي، انتفخت وأصبحت ضمادة جروح حديثة، توفر حماية جيدة من العدوى الخارجية والشفاء السريع بسبب التركيبة التي تمتص الرطوبة.

وُضعت ضمادات شاش متعددة الطبقات على أفلام بوليبور ومناديل ليتا كولور وخيطت على جلد الفئران لتثبيت أقوى. ووُضع كل فأر في قفص منفصل لتهيئة الظروف المثلى لصيانته وزرع الخلايا الكيراتينية المزروعة. ورُطبت ضمادات الفئران التي زُرع فيها المعلق والطبقة متعددة الطبقات من الخلايا الظهارية التي أُزيلت بواسطة ديسبز بمحلول ملحي معقم عدة مرات يوميًا لتهيئة الظروف الأكثر ملاءمة لزرع الخلايا. ونظرًا لأن فيلم بوليبور كان غير منفذ للماء، لم تُبلل ضمادات الفئران في المجموعة الثانية، وكانت هذه إحدى مزاياها مقارنةً بعمليات الزرع بدون أفلام. أُزيلت الضمادات بعد 10 أيام. لم تختلف الصورة السريرية للندبات بعد زرع الخلايا كثيرًا عن الندبات بدون زرع، باستثناء لونها الوردي (بسبب تقشير الجلد) وتقشيرها بشكل أكبر. تشير هذه الحقيقة إلى ذلك. أنه بعد سقوط الضمادات الجرحية مباشرة باستخدام MPC، لم يحدث أي تغيير في الندبة.

أخذ مادة الخزعة من الفئران.

بعد مرور شهر، شهرين، خمسة أشهر، وتسعة أشهر على زراعة الخلايا الكيراتينية الخيفية للفئران على ندوب مصقولة من فئران بيضاء، أُخذت عينات من الجلد الطبيعي للفئران والندبة دون زراعة خلايا كعينة ضابطة. خُدِّرت الفئران باستخدام التخدير الأثيري.

بعد التخدير، أُخذت قطع من النسيج الندبي من المناطق المحددة التي زُرعت فيها الخلايا الكيراتينية باستخدام مثقاب خزعة بقطر 2 مم، ووُضعت في محلول غلوتارالدهيد بتركيز 2.5% لتحضير المادة للفحص المجهري الإلكتروني. وُضعت قطع الأنسجة المأخوذة للفحص النسيجي في محلول فورمالين متعادل بتركيز 10%، ثم مُرّرت عبر الكحولات وغُرست في البارافين، ثم قُطعت مقاطع رقيقة للغاية وعُرضت تحت مجهر ضوئي بصري.

السيطرة 1. جلد الفئران الطبيعي.

من أجل رؤية الفرق بين الصورة المجهرية لجلد الفئران الطبيعي المتغير بالندبات والندبات في أوقات معينة بعد زراعة الخلايا الجذعية السرطانية، يتم عرض الصور والأوصاف الخاصة بها في جميع مراحل هذه الدراسة.

تتكون بشرة الجلد الطبيعي من 7-9 طبقات من الخلايا. الطبقة القرنية متوسطة السمك. تتكون في بعض الأماكن من 6-8 طبقات من القشور القرنية. تمثل الطبقة القاعدية خلايا أسطوانية ذات نوى كبيرة وخفيفة ومنتظمة الشكل والعديد من النويات. يتم التعبير بوضوح عن الوصلات الدسموسومية بين الخلايا ومع الغشاء القاعدي. تحت الغشاء القاعدي المحدد جيدًا، والذي يحتوي على نتوءات صغيرة في الطبقة تحت البشرة، توجد بالتوازي معه حزم دقيقة من ألياف الكولاجين والإيلاستين، من بينها الخلايا الليفية الطويلة والأوعية الصغيرة. في الطبقات العميقة، تقع حزم ألياف الكولاجين والإيلاستين في اتجاهات مختلفة. من بينها العديد من الأوعية ذات الجدران الرقيقة من نفس العيار، والعناصر الخلوية (الخلايا الليفية، والخلايا البدينة، وكريات الدم البيضاء). عدد كبير من بصيلات الشعر، والغدد الدهنية.

التحكم 2. ندبة الفأر، عمرها شهرين.

الصورة السريرية: ندبات وردية باهتة، مع تقشير، وتبقى قشور في بعض الأماكن. تقلصت مساحتها بسبب تقلص ألياف الكولاجين، وأصبحت حوالي 3.0-3.5 سم ^. لا توجد زوائد جلدية.

صورة مجهرية. تتكون البشرة من 3-5 طبقات من الخلايا المطوية، ممثلة بخلايا قاعدية مستديرة، صف واحد من الخلايا الفرعية، صف واحد إلى صفين من الخلايا الحبيبية مع حبيبات الكيراتوهيالين في الطبقة العليا، وهناك مناطق من الوذمة داخل الخلايا. تتغير الطبقة القرنية بشكل غير متساوٍ من رقيقة جدًا إلى سميكة. يُلاحظ طي الندبة بسبب (انكماش) النسيج الندبي. تخترق الطيات الطبقة الحليمية وتشكل انطباعًا بالحليمات. الحدود بين البشرة والأدمة عبارة عن خط مستقيم. لا يتم تتبع الغشاء القاعدي في كل مكان. في الجزء السفلي من الطبقات تحت البشرة والطبقات العميقة توجد أوعية ذات جدار سميك ومرتخي، والعديد منها مهجور وركود. حول الأوعية يوجد تراكم للخلايا البلعمية والأرومات الليفية. تحيط الخلايا البلعمية بكريات الدم الحمراء المنبعثة من الشعيرات الدموية وتبلعمها. في الطبقات السطحية، توجد شعيرات دموية صغيرة. وتحت البشرة، توجد ألياف الكولاجين بشكل فضفاض. أما في الطبقة العميقة من الندبة، فتوجد حزم خشنة من ألياف الكولاجين، من بينها العديد من الخلايا الليفية.

ندبة الفئران بعد شهر واحد من زراعة الخلايا الكيراتينية للفئران.

الصورة السريرية: الندبات وردية اللون، ومساحتها، وخاصةً قطرها، قد تقلصت، ويبلغ متوسطها ٢.٥-٣ سم² ^. لا يوجد شعر أو غدد دهنية.

بيانات الفحص المجهري للمادة المُستحصل عليها من الفئران بعد زراعة MPaLK على الفيلم وMPaLK بدون ركيزة متطابقة عمليًا. ومع ذلك، من الناحية التقنية البحتة، يُعد العمل مع MPaLK بدون ركيزة أكثر تعقيدًا وجهدًا من زراعة MPaLK على ركيزة. لذلك، في دراستنا المُتعمقة لمسألة زراعة الخلايا الكيراتينية في الندبات، استخدمنا قماش الكامبريك متعدد الطبقات كأساس للزراعة ("الركائز").

صورة مجهرية. يُلاحظ سماكة البشرة إلى 15-20 طبقة، تقريبًا في منتصفها، حيث تتميز الخلايا الكيراتينية بشكلها الضيق والمستطيل والعمودي وترتيبها المتماسك. تقع الخلايا القاعدية في خط غير مستوٍ. أنويتها خفيفة وكبيرة ومستديرة، وتحتوي على نوية أو نويتين، مما يدل على نشاطها التركيبي والتكاثري العالي. الحدود بين البشرة والأدمة خط مستقيم. الطبقة الشوكية متطورة جيدًا، وتتكون من 3-5 طبقات من الخلايا المستديرة، وتحتوي على خليتين نوويتين.

تقع مباشرةً تحت الغشاء القاعدي حزمٌ رقيقةٌ كثيفةٌ من ألياف الكولاجين، وبالتوازي معها عددٌ كبيرٌ من الأوعية الدموية المهجورة، وألياف الكولاجين العميقة أكثر خشونةً، وتتجمع في حزمٍ كثيفة. تحيط بها ألياف كولاجين غير مترابطة، مثل العديد من الخلايا الليفية الكبيرة، والخلايا البدينة (2-3 في مجال الرؤية)، والبلعميات، وكريات الدم البيضاء، والأوعية الدموية المهجورة، وجدرانها المرتخية. في بعض الأوعية، يحدث ركودٌ للعناصر المتكونة. وتحيط بها الخلايا الليفية، والخلايا الليمفاوية المفردة. ولا توجد زوائد جلدية.

عند زرع مُعلّق الخلايا الكيراتينية على ندبة مصقولة، تختلف الصورة المجهرية عن الصورة السابقة. في معظم الحيوانات، تكون البشرة رقيقة وتتكون من 5-6 طبقات من الخلايا. تتكون الطبقة السفلية من خلايا غير منتظمة الشكل ومضلعة، ذات نوى دائرية غير منتظمة الشكل. تتشابه حالة الطبقة تحت البشرة مع حالتها في مجموعة الحيوانات التي لم تُجرَ لها عملية زرع MPALK.

في هذه الحالة، يُمكن الحديث إما عن تأخر في العمليات المصاحبة لزراعة الخلايا، أو عن فقدان كبير للخلايا المزروعة على شكل معلق. ومن هنا، خلصنا إلى عدم جدوى تصحيح الندبات بزراعة الخلايا الكيراتينية على شكل معلق.

ندبة الفئران بعد شهرين من زراعة الخلايا الكيراتينية للفئران.

الصورة السريرية: تبدو الندبة رقيقة وحساسة. في بعض الأماكن، تظهر بقع متقشرة ومتقشرة.

صورة مجهرية. الطبقة القرنية سميكة، وفي بعض الأماكن فرط التقرن. البشرة سميكة، وتتكون من ١٢-٢٠ صفًا من الخلايا. الحدود بين البشرة والأدمة خط مستقيم. ألياف الكولاجين الرقيقة تحت البشرة كثيفة جدًا. في الطبقات العميقة من الندبة، تتجمع هذه الألياف في حزم خشنة كبيرة. في الطبقة تحت البشرة، تظهر تكوينات وعائية جديدة. في الطبقات السفلية من النسيج الندبي، توجد العديد من الأوعية الدموية المهجورة الموازية لسطح البشرة. تتوزع الخلايا الليفية الكبيرة بالتساوي في سمك الندبة، وهناك العديد من الخلايا البلعمية العملاقة متعددة الفروع.

ندبة الفئران بعد 5 أشهر من زراعة خلايا البشرة لدى الفئران.

الصورة السريرية: تبدو الندبة متساوية وناعمة دون تقشر، مع وجود شعرات مفردة، وكثافتها أكبر على محيط الندبة، مما يدل على نمو هامشي لبصيلات الشعر داخل الندبة وتكوين بصيلات شعر جديدة. يستمر تناقص مساحة الندبات.

صورة مجهرية. لا تزال البشرة سميكة (15-20 طبقة، وفي بعض الأماكن تصل إلى 30 طبقة). في الطبقات العليا، تكون مليئة بحبيبات الكيراتوهيالين. الغشاء القاعدي واضح للعيان. تحته، تتمدد ألياف الكولاجين بشكل فضفاض. في الطبقات السفلى، يكون الكولاجين أقوى وأكثر كثافة. توجد العديد من الشعيرات الدموية بين حزم الكولاجين. في الطبقات العليا، انخفض عدد الأوعية الدموية المهجورة. يكون تقاطع البشرة والأدمة متموجًا بعض الشيء. في بعض الأماكن، توجد نتوءات جلدية عميقة في النسيج الندبي. تظهر أوعية دموية حديثة التكوين بين ألياف الكولاجين. تظهر بصيلات شعر مفردة وغدد دهنية.

ندبة الفئران بعد 9 أشهر من زراعة خلايا MPA الظهارية للفئران.

الصورة السريرية: أصبحت الندبات أصغر حجمًا بشكل ملحوظ مقارنةً بالفترات السابقة، حيث يبلغ متوسط مساحتها حوالي 1.5-2.0 سم² ^. الندبات مغطاة بشعر ناعم بشكل غير متساوٍ، خاصةً على الأطراف. يبقى تقشير بسيط في الصفائح الدقيقة.

صورة مجهرية.

أصبحت البشرة أرق، ويمثلها 6-8 صفوف من الخلايا، وتشبه بشرة جلد الفئران الطبيعي في البنية، إلا أن كثافة الخلايا أعلى بمقدار 1 مم وهي أصغر. تتكون الطبقة القاعدية من خلايا صغيرة مستديرة أسطوانية. يتم التعبير عن الغشاء القاعدي جيدًا، وتكون الهيميدسموسومات مرئية بوضوح. لوحظ وجود نتوءات بشروية في الطبقة تحت البشرة. يتم التعبير عن الطبقة الحليمية على طول الندبة بالكامل. تشير هذه الحقائق إلى أنه بحلول هذا الوقت أصبح التصاق الخلايا الكيراتينية المزروعة أقوى بكثير مع أنسجة الندبة الأساسية. لذلك، يمكن أن تكون العناية بالندبات لدى الأشخاص الذين خضعوا لعملية زرع MPALK بعد 9 أشهر من زراعة MPC تقليدية. تكون ألياف الكولاجين تحت البشرة أكثر حساسية من الطبقات العميقة. ظهرت العديد من الأوعية الدموية، وخاصة السطحية منها. جدران الأوعية الأكبر سميكة. توجد بصيلات الشعر والغدد الدهنية بكميات كبيرة. الصورة المجهرية تشبه الأنسجة الشبيهة بالجلد.

نتائج العمل التجريبي ومناقشتها.

خلال هذا العمل، زُرعت الخلايا الكيراتينية بأشكال مختلفة على ندوب جلدية مصطنعة للفئران بعد جراحة تقشير الجلد - على أغطية الجروح، وكتعليق على قماش الكامبريك، وكطبقة متعددة الطبقات بدون ركيزة. أُجري هذا العمل بهدف الحصول على بيانات مورفولوجية حول تأثير الخلايا الكيراتينية الخيفية المزروعة على الندوب، بالإضافة إلى تحديد خيارات الزرع المثلى.

وُجد أن جميع طرق الزرع الثلاث ممكنة، إلا أن زراعة غشاء البكارة المحيطي (MPAC) بدون ركيزة تتطلب جهدًا كبيرًا، وقد تُصاب هذه الغشاء، مما يؤثر على نتائج الزرع. علاوة على ذلك، تستثني هذه الطريقة العمل على مساحات واسعة.

زراعة الخلايا الكيراتينية المعلقة هي طريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة، ولا تتطلب زراعة خلايا طويلة الأمد، وهي بسيطة في نسختها المقترحة باستخدام فراغات كامبريك معقمة، تتوافق أحجامها مع حجم الندبات. لا يُعدّ تأخر التأثير العلاجي لزراعة الخلايا المعلقة بحوالي شهر، مقارنةً بخلايا MPC على طلاء الجروح، نقطة مهمة نظرًا لطول فترة العلاج. من المعروف أنه عند زراعة خلايا MPC لمرضى الحروق، يحدث تحول في بنية الجلد تدريجيًا وعلى مدى عدة سنوات. تُعد زراعة خلايا الكيراتين على طلاء الجروح الطريقة الأكثر ملاءمة وواعدة، ولكنها أيضًا أكثر تكلفة بكثير. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه الطريقة حاليًا البحث عن خيارات طلاء أكثر تطورًا، يجب أن تكون مرنة، ومضادة للرطوبة، وذات خصائص مضادة للبكتيريا أو قاتلة للبكتيريا، ومحايدة بيولوجيًا للخلايا. الفيلم "بوليبور" - وهو نسخة وسيطة من الفيلم المحلي لتغطية الجروح، على الرغم من بعض العيوب، سمح لنا بدراسة تجربة زرع الخلايا الكيراتينية للفئران على الندبات واستخلاص استنتاجات حول فعالية هذا الاتجاه من علاج الندبات.

لاحظ الباحثون الذين زرعوا خلايا MPC على جروح الحروق أنه خلال الأسبوع الأول بعد زرع طبقة متعددة الطبقات من الخلايا الكيراتينية على جروح معقمة، ازدادت سماكة البشرة وتدرجت طبقاتها. وكانت جميع طبقات البشرة ظاهرة بوضوح. ومن المثير للاهتمام أن عدد طبقات الخلايا في عمليات الزرع كان أكبر بنسبة 10-30% منه في خزعات الجلد. ولاحظ الباحثون ظهور حبيبات الكيراتوهيالين في اليوم الخامس بعد زرع خلايا MPC، وظهور الغشاء القاعدي والهيميدسموسومات في اليوم الثالث.

وجد J.Rives et al. (1994)، Paramonov BA (1996)؛ Kuznetsov NM et al. (1998) أنه في المراحل المبكرة بعد زرع الخلايا الكيراتينية الخيفية للمرضى الذين يعانون من عيوب جلدية كاملة السماكة بعد الحروق، يكون الاتصال بين الأدمة والبشرة ضعيفًا جدًا ويكون خطًا مستقيمًا، وتكون الطبقة الحليمية غائبة. بحلول نهاية الشهر الثاني، تبدأ الحليمات الضحلة وملحقات الجلد في التكون، ويصبح الاتصال بين الأدمة والبشرة أقوى. تشير بيانات الأدبيات إلى أن زرع الخلايا الكيراتينية الخيفية على الجروح لدى مرضى الحروق هو طريقة واعدة. على الرغم من حقيقة أن رفض الخلايا الكيراتينية الخيفية يحدث، وفقًا لمؤلفين مختلفين، في غضون 10 أيام إلى 3 أشهر، إلا أنها مع ذلك تلعب دورها في التئام سطح الجرح وإفراز عوامل النمو وإغلاق العيب ميكانيكيًا. يُعتقد أن خلايا MPALC لها نشاط مستضدي منخفض، لأنها تفقد خلايا لانغرهانس أثناء زراعتها في المختبر، مما يسمح لها بالبقاء في جسم المتلقي لفترة طويلة. علاوة على ذلك، تتمتع المزرعة الخيفية المأخوذة من جلد شباب أصحاء بإمكانيات بيولوجية أكبر بكثير من المزرعة الذاتية للمرضى بعد الإصابة.

كان الهدف الرئيسي من دراستنا هو معرفة ما إذا كانت الخلايا الكيراتينية الخيفية ستترسخ في الندبات، وما هي التغيرات التي ستطرأ على نسيج الندبة تحت تأثير هذا "الغلاف" النشط بيولوجيًا. وفي حال التوصل إلى نتيجة إيجابية، سنسعى إلى تطوير أكثر التقنيات فعالية وأقلها تكلفةً في هذا المجال من طب إعادة التأهيل.

كانت البيانات التي حصلنا عليها مشابهة من نواحٍ عديدة لبيانات الأدبيات حول التغيرات المورفولوجية التي تحدث في البشرة البشرية بعد زراعة الخلايا الكيراتينية الخيفية في جروح الحروق. ومع ذلك، توجد أيضًا اختلافات كبيرة، سواء من حيث الركيزة المورفولوجية التي تُجرى عليها الزراعة أو من حيث التكنولوجيا. وبالتالي، فإن عملية تكوين الغشاء القاعدي والوصلات الجلدية-البشرية (الهيميدسموسومات، الحليمات) تحدث في مرحلة لاحقة مقارنةً بزراعة الخلايا الكيراتينية على أسطح الجروح دون تغيرات ندبية. ويبدو أن هذا يحدث بسبب سوء تغذية النسيج الندبي مقارنةً بالأدمة أو اللفافة العضلية. الندبة، وخاصة القديمة منها، هي نسيج ضام كثيف ذو عدد قليل جدًا من الأوعية الدموية، بينما يكون الجزء السفلي من جرح الحروق نسيجًا حبيبيًا غنيًا بالأوعية الدموية. وبالتالي، من الواضح أن الظروف التي تحدث فيها زراعة الخلايا الكيراتينية وزرعها مختلفة تمامًا. كلما كانت منطقة زراعة الخلايا غنية بالأوعية الدموية، كانت عملية زرعها أسهل. ومن هذا المنطلق، يُستنتج تفضيل العمل مع الندبات الحديثة، حيث لا يزال النسيج الضام رخوًا وغنيًا بالأوعية الدموية.

ونتيجة لهذا العمل التجريبي فقد ثبت أن:

1. من الممكن زراعة MPALK على الندبات.
2. الطريقة المثلى للزراعة هي زراعة الخلايا الكيراتينية على غطاء الجرح.
3. ينبغي تلميع سطح الندبة باستخدام تقشير الجلد بالليزر الجراحي أو قاطع شومان.
4. تحت تأثير MPALK، يحدث التئام سريع للسطح المصقول للندبة.
5. كلما كانت أنسجة الندبة أكثر وعائية، أي كلما كانت الندبة أصغر سنا، كلما كانت نتائج زراعة الخلايا الكيراتينية أفضل.
6. تحت تأثير الخلايا الكيراتينية المزروعة، يتحول النسيج الندبي تدريجيا إلى نسيج يشبه الجلد (نسيج ندبي أكثر ارتخاء مع ملحقات جلدية).
7. ارتخاء تدريجي للنسيج الندبي، بدءًا من الطبقة تحت البشرة. يتحسن تكوين الأوعية الدموية فيه، وتتخذ حزم ألياف الكولاجين في الجزأين العلوي والسفلي من الندبة ترتيبًا أكثر ارتخاءً مقارنةً بالنسيج الندبي دون زراعة الخلايا. تظهر بصيلات الشعر والغدد الدهنية. تقترب البشرة، في بنيتها، بعد تجاوزها مرحلة التضخم، من بشرة الجلد الطبيعي.
8. ترتبط التغييرات الملاحظة بعوامل النمو والسيتوكينات التي تفرزها الخلايا الكيراتينية، والتي تعمل من خلال تحسين التغذية في الأنسجة الندبية، على تعزيز تحولها من نسيج ليفي خشن إلى نسيج أكثر مرونة، مما يؤدي إلى تحسن في مظهر الندبة.

وبناء على هذه الدراسة، يمكن الاستنتاج أن الخلايا الكيراتينية المزروعة لها تأثير مفيد على الأنسجة الندبية، مما قد يكون له آثار عملية على إعادة تأهيل المرضى الذين يعانون من أنواع مختلفة من الندبات.

كما سمح لنا هذا العمل على الفئران بصياغة المتطلبات اللازمة لتغطية الجروح التي تنمو عليها الخلايا الكيراتينية.

ينبغي أن تكون ضمادات الجروح:

• متوافق حيويا مع الخلايا،
• قابل للتنفس،
• لها قاعدة مرنة تشكل الشكل،
• تكون محبة للماء،
• حيث تحتوي الإضافات الطبية على أدوية مضادة للبكتيريا ومضادات الأكسدة التي ليست سامة للخلايا المزروعة.

النتائج السريرية للعلاج البيوتكنولوجي للندبات.

سابقًا، وجد ن. كارفر وآخرون (1993) أن الضمادات الانسدادية تُعزز التصاق الخلايا الكيراتينية بالجرح بشكل أفضل، لكنها لا تسمح بتكوين بشرة طبقية (ناضجة). يتطلب تكوين البشرة الطبقية بيئة هوائية. لذلك، بعد التصاق طبقة متعددة الطبقات، اقتُرح إزالة الضمادة الانسدادية بعد 7-10 أيام، وعلاج الجروح بضمادات جافة أو مراهم قابلة للذوبان في الماء. يمكن القول إن جودة وخصائص "الركيزة" التي تُزرع عليها الخلايا تُعدّ عاملًا بالغ الأهمية لفعالية زراعة المواد الخلوية، وبالتالي لنتائج عمل الأطباء. لكن لا يوجد ضمادة جروح مثالية اليوم، على الرغم من وفرة الخيارات المقترحة (الجلد الاصطناعي، والنسيج غير المنسوج المصنوع من كربوكسي ميثيل السليلوز، وطلاءات الفيبرين، وأغشية البولي يوريثان شبه النفاذة). ومن النقاط المهمة في هذا الموضوع تكلفة "الركائز" (أغطية الجروح الخاصة)، حيث أن تكلفتها المرتفعة تزيد من التكلفة الإجمالية للعلاج التكنولوجي الحيوي.

أثبتت تقنيات الخلايا فعاليتها حتى الآن، إلا أنها، للأسف، باهظة التكلفة، خاصةً في الدول التي لم يستقر فيها الإنتاج الصناعي لتركيبات الخلايا. مع ذلك، لطالما أسست دول مثل الولايات المتحدة صناعةً لإنتاج مواد الخلايا المستخدمة في زراعة الحروق. على وجه الخصوص، قامت شركة BioSurface Technology Inc. منذ عام ١٩٨٩ بزراعة ٣٧ ألف طبقة من الخلايا الكيراتينية متعددة الطبقات، والتي استُخدمت لعلاج ٢٤٠ مريضًا في ٧٩ دولة حول العالم (R. Odessey، ١٩٩٢)، في حين أن تكلفة زراعة سم مربع واحد من الخلايا ^تتراوح بين ٧ و٨ دولارات أمريكية.

تختلف تقنية علاج الأمراض والمشاكل الجلدية المختلفة اختلافًا كبيرًا، لكن أي علاج للخلايا يعتمد على الحصول على مادة خلوية عالية الجودة وزرعها.

تتكون هذه العملية من الخطوات التالية:

• أخذ الجلد من الضحايا (أو من المتبرعين)،
• نقل رفرفات الجلد إلى مركز التكنولوجيا الحيوية،
• عزل خلايا الطبقة القاعدية وتكاثرها،
• نمو طبقات الخلايا الكيراتينية متعددة الطبقات (MLK).
• زراعة الخلايا.

تكمن المشكلة الرئيسية في إجراء العلاج بزراعة صفائح الخلايا الكيراتينية متعددة الطبقات في الحاجة إلى خلايا حية في جميع مراحل عملية الزرع. يجب أن تكون قطع الجلد المستخدمة لعزل الخلايا الذاتية أو المتماثلة رقيقة قدر الإمكان، إذ يسهل في هذه الحالة فصلها بالطرق الميكانيكية والإنزيمات، والحصول على معلق من الخلايا الحية للزراعة. يمكن الحصول عليها عن طريق القطع باستخدام أداة القطع الجلدي، أو باستخدام جلد الجفون، والقلفة، والسطح الداخلي للكتف. ونظرًا لحساسية هذه الخلايا للهالوجينات (الكلور، واليود)، وبيروكسيد الهيدروجين، فلا يمكن استخدامها عند معالجة الجلد أثناء جمع المواد.

تعتمد جودة وكمية خلايا الطعوم الجلدية وكفاءة زراعتها أيضًا على صحة المتبرع وعمره. بالإضافة إلى ذلك، يجب إرسال خزعات الجلد بأسرع وقت ممكن وفي ظل ظروف مناسبة (بيئة ودرجة حرارة) إلى مختبر معتمد ومعتمد لهذه الأغراض.

لتخزين ونقل رفرفات الجلد، يمكن استخدام وسط Eagle أو وسط 199 مع إضافة 10% من مصل البقر، أو وسط DMEM مع إضافة 5% من مصل الجنين البقري والمضادات الحيوية.

في مختبر علم الخلايا، يتم أولاً تقسيم خزعة الجلد ميكانيكيًا إلى قطع صغيرة، ثم تتم معالجة قطع الجلد باستخدام الإنزيمات: التربسين، الكولاجيناز، الديسباس، إلخ.

تحت تأثير الإنزيمات، تُدمر الديسموسومات وتُطلق الخلايا الكيراتينية في الوسط على شكل خلايا فردية أو تجمعات تتكون من أعداد مختلفة من الخلايا. تُستخدم الخلايا الكيراتينية القاعدية فقط للزراعة، والتي تُزرع على بيئات خاصة في منظمات حرارة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون، في أطباق بتري أو في قوارير عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة، يُلاحظ تكوين مستعمرات من الخلايا الكيراتينية، والتي تندمج تدريجيًا لتتحول إلى طبقة أحادية. بعد تلقي عدد كافٍ من الخلايا، يُزرع المُعلق الناتج على ضمادات جروح مُجهزة لهذا الغرض ويوضع في أطباق بتري. أولاً، تتكون طبقة أحادية ثم طبقة متعددة الطبقات من الخلايا الكيراتينية من المُعلق. تظهر مراحل عملية زراعة الخلايا الكيراتينية تخطيطيًا في الشكل 12 (33،43،54،65).

عادةً ما يستغرق تكوين طبقة متعددة الطبقات من الخلايا الكيراتينية، مناسبة للزراعة، من 7 إلى 10 أيام. وقد تطول هذه المدة أحيانًا، وذلك يعتمد على جودة المادة المصدر (العمر، الحالة الصحية للمتبرع، دقة جمع المادة، جودة الوسط المستخدم، إلخ). في حال فرط نمو الطبقة متعددة الطبقات، فقد تظهر على سطحها خلايا غير مناسبة للزراعة، وهي خلايا مُصابة بظاهرة موت الخلايا المبرمج. تُسلّم أطباق بتري، التي تحتوي على طبقات متعددة الطبقات من الخلايا الكيراتينية (MLK)، المزروعة فيها على أغطية الجروح، إلى العيادة في حاويات خاصة بدرجة حرارة لا تقل عن 15 درجة مئوية.

طريقة جرين المعدلة لزراعة MPC

في عملنا، استخدمنا قماش الكامبريك متعدد الطبقات لتغطية الجروح، متخليين عن أغشية "بوليبور" التي بدأنا بها العمل في تجربة الفئران. وهكذا، قمنا بتنمية طبقات من الخلايا الكيراتينية متعددة الطبقات على قماش الكامبريك منزوع الدهون مسبقًا والمعقم، مع أنه ليس تغطية مثالية للجروح.

تم إجراء الدراسات السريرية على المتطوعين وفقًا للمعايير الأخلاقية اللازمة: توقيع اتفاقية والموافقة المستنيرة.

1. تم استخدام ثقافة الخلايا الكيراتينية الخاصة بالمريض (ذاتية) والمخزنة (خيفية).
2. تم الحصول على الخلايا الكيراتينية الخاصة بالمرضى من قطعة من الجلد مقطوعة من الجزء الداخلي من الجزء العلوي من أذرعهم.
3. تم إجراء جراحة تقشير الندبات باستخدام الكي الحراري والأقراص الدوارة والليزر الإربيوم.
4. تم أخذ مجموعات من المرضى الذين يعانون من ندبات طبيعية وناقصة التشكل وتضخمية.

تتكون العملية التكنولوجية لتطبيق تقنية الخلايا لتحسين مظهر ندبات الجلد من المراحل التالية:

1. اختيار المريض.
2. توضيحات حول جوهر العلاج، والمدة الزمنية للحصول على النتائج المتوقعة، وتوقيع العقد والموافقة المستنيرة.
3. يصف للمرضى قبل الجراحة بـ 2-3 أسابيع قرص واحد من سيلمفيت 3 مرات يوميًا، وقرص واحد من زينكثيرال 3 مرات يوميًا.
4. يتم أخذ قطعة من الجلد بطول 2.0 سم وعرض 0.7-1.0 سم من السطح الداخلي للكتف، عالياً، تقريباً في الجزء السفلي من منطقة الإبط للحصول على الخلايا الكيراتينية الذاتية.
5. في الحالات التي رفض فيها المرضى عزل الخلايا الكيراتينية الخاصة بهم بسبب احتمال وجود ندبة خطية على السطح الداخلي للكتف، تم أخذ المواد الخلوية من بنك الخلايا (الخلايا الكيراتينية المتماثلة).
6. تم عزل الخلايا الكيراتينية وزراعتها في مختبر معتمد لهذا النوع من العمل.
7. بعد الحصول على كمية كافية من MPC لزراعتها على الندبات، تم تحديد يوم للعملية في العيادة، حيث تم إحضار المواد في حاويات خاصة في أطباق بتري.
8. أُجريت عملية تقشير جلدي للندبات، ووقف النزيف، وغُسل السطح المصقول بمحلول ملحي معقم، وجُفّف، ثم زُرعت خلايا الظهارة المتوسطة عليه باستخدام "خلايا كامبريكية" معقمة. أي أن الخلايا العلوية في خلايا الظهارة المتوسطة أصبحت سفلية، مجاورة للسطح المصقول.
9. وُضع غشاء معقم فوقه، ثُبّت على الجلد بضمادة مرنة أو لاصقة أومنيفكس مرنة. وبدلًا من الغشاء، يُمكن استخدام ضمادات جروح أخرى تحتوي على السيليكون، مثل ميبيتيل، وميبيفورم، وصفائح هلام السيليكون.

بعد ٥-٧ أيام، يُزال الغشاء أو طبقة السيليكون. في هذا الوقت، تكون جميع الخلايا الكيراتينية قد زحفت إلى الندبة المصقولة والتصقت بسطحها.

10. تساهم البيئة الرطبة المُكوّنة تحت الغشاء وطلاء السيليكون بشكل فعّال في ذلك. يُمكن تشريب طبقة الكامبريك المتبقية على الندبة من هذه النقطة فصاعدًا بجلّ الكيروسين أو الكيتوزان. ونتيجةً لذلك، تتكون قشرة كثيفة في اليوم الثاني، والتي يُفضّل تثبيتها، لراحة المريض، برقعة مرنة وجيدة التهوية، مثل Omnifix. تسمح هذه القشرة القابلة للتهوية للبشرة المُكوّنة بالتمايز والتحول إلى بشرة ناضجة.

بناءً على نوع الندبة وعمق الطحن، تُرفض الضمادة بعد 8-10 أيام. في هذه المرحلة، تكون طبقات الخلايا في البشرة أكثر بنسبة 30-40% من طبقات الجلد الطبيعي. لا يتشكل الغشاء القاعدي. تُفرز الخلايا الكيراتينية في البشرة السميكة الكثير من الجزيئات النشطة بيولوجيًا في نسيج الندبة.

يعتمد نجاح علاج الندبات بالتقنيات الحيوية بشكل كبير على طريقة الرعاية المتبعة بعد الجراحة. تُعدّ مزارع الخلايا نوعًا "لطيفًا" من تغطية الجروح، وفي المراحل المبكرة بعد الزراعة، يُمكن تقشير خلايا IPCs بسهولة من الأنسجة الكامنة. لذلك، يُنصح المرضى بالتعامل مع الندبة بحذر بعد الجراحة. لمدة 8-9 أشهر، يجب عدم فرك الندبة، ومعالجتها بلطف بالماء البارد المغلي لتجنب تمزيق الطبقة الرقيقة حديثة التكوين، والتي لا تلتصق جيدًا بالأنسجة الكامنة.

ملحوظة.

قبل الجراحة وأثناء تقشير الجلد، يُسمح باستخدام المطهرات والمؤكسدات الهالوجينية (يودوبيرون، سوليودوبيرون، يودينول، يودينات، كلورهيكسيدين، بيروكسيد الهيدروجين). أما قبل زراعة الخلايا، فيُمنع منعًا باتًا نظرًا لتأثيرها السام للخلايا. كما أن اللون الأزرق الميثيليني والأخضر اللامع سامان للخلايا.

لتجنب العدوى، خاصةً عند العمل على الندبات الضخامية، يُمكن معالجة المجال الجراحي بكبريتات النيومايسين، أو بوليميكسين، أو جنتاميسين. فهي لا تُسبب أي تأثير سام للخلايا الكيراتينية.

ونتيجة لهذا العلاج يتم تحقيق تأثير ثلاثي.

1. تسوية سطح الندبة.
2. إنشاء طبقة جديدة من البشرة ذات سمك طبيعي فوقها.
3. تحويل النسيج الندبي إلى نسيج يشبه الجلد بسبب عمل السيتوكينات وعوامل النمو والجزيئات النشطة بيولوجيًا الأخرى التي تفرزها الخلايا المزروعة وتحفزها الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية والبلعميات.

تصبح الندبة أقل وضوحًا وأكثر مرونة وتظهر فيها المسام والشعر الزغبي، ويمكن استعادة التصبغ بسبب وجود الخلايا الصبغية في IPC.

ومع ذلك، فإن جميع هذه الجوانب الإيجابية للندبة لا تظهر فورًا. في هذا الصدد، من الضروري تحذير المرضى من أن عملية تحول النسيج الندبي إلى نسيج جلدي تحدث ببطء، ولا يمكن توقع النتيجة المثلى لهذا العلاج قبل 10-14 شهرًا. فور رفض الضمادات، تتميز الأسطح المصقولة بتعدد ألوان واضح، وكلما كان اللون أفتح، كان التلميع أعمق. يُلاحظ أقل ضرر للجلد عند تلميع الندبات الطبيعية باستخدام ليزر الإربيوم. استُعيد لون الندبات والجلد المحيط بها في غضون 3 إلى 8 أسابيع. على الرغم من هذه الاحتياطات، يحدث أحيانًا فرط تصبغ بعد الجراحة، والذي قد يختفي من تلقاء نفسه في غضون بضعة أشهر.

[ 1 ]، [ 2 ]، [ 3 ]، [ 4 ]، [ 5 ]، [ 6 ]، [ 7 ]، [ 8 ]، [ 9 ]، [ 10 ]