الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري

يُعد دم الحبل السري مصدرًا جيدًا للخلايا الجذعية المكونة للدم من حيث قدرتها على التكاثر وإعادة التكاثر. وقد ثبت مرارًا وتكرارًا أنه بحلول وقت الولادة، يحتوي دم الحبل السري على عدد كبير بما فيه الكفاية من الخلايا السلفية المكونة للدم ضعيفة الارتباط. ويعتقد بعض الباحثين أن ميزة زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري تتمثل في عدم الحاجة إلى البحث عن متبرع متوافق مع مستضدات HLA. ويرون أن عدم نضج الجهاز المناعي للمولود الجديد يُسبب انخفاضًا في النشاط الوظيفي للخلايا المناعية الكفؤة، وبالتالي انخفاضًا في معدل الإصابة بمرض الطعم ضد المضيف الشديد مقارنةً بزراعة نخاع العظم. في الوقت نفسه، لا يقل معدل البقاء على قيد الحياة بعد زراعة خلايا دم الحبل السري عن معدل البقاء على قيد الحياة بعد زراعة خلايا نخاع العظم، حتى في حالة استخدام عدد أقل من الخلايا الجذعية المكونة للدم لكل كيلوغرام واحد من وزن جسم المريض. ومع ذلك، في رأينا، فإن قضايا العدد الأمثل لخلايا دم الحبل السري المزروعة المطلوبة للزرع الفعال في جسم المتلقي، وتوافقها المناعي، وعدد من الجوانب الأخرى لمشكلة زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري تتطلب تحليلاً أكثر جدية.

[ 1 ]، [ 2 ]، [ 3 ]، [ 4 ]، [ 5 ]، [ 6 ]

الحصول على الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري

يتطلب إجراء استخلاص الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري جمعها فور ولادة الطفل وفصلها عن المشيمة، سواءً كانت داخل الرحم أو خارجه، وكذلك أثناء الولادة القيصرية، وحتى خارج الرحم. وقد ثبت أنه إذا تم تقصير الفترة الزمنية من لحظة الولادة إلى انفصال المولود عن المشيمة إلى 30 ثانية، فإن حجم دم الحبل السري المُستخلص يزداد بمعدل 25-40 مل. وإذا أُجري هذا الإجراء لاحقًا، تُفقد نفس كمية الدم. وقد ثبت أن انفصال الطفل عن المشيمة مبكرًا لا يُسبب أي عواقب سلبية على المولود.

طوّر المعهد الروسي لأبحاث أمراض الدم ونقل الدم تقنيات فعّالة ومنخفضة التكلفة للحصول على دم الحبل السري أثناء الولادة الطبيعية (70.2+25.8) مل) والولادة القيصرية (73.4+25.1) مل). واقترح طريقة لفصل دم الحبل السري ذات إنتاجية عالية من الخلايا النووية والخلايا أحادية النواة (83.1+9.6) و(83.4+14.1)% على التوالي. كما حُسِّنت طريقة لحفظ دم الحبل السري بالتبريد، مما يضمن الحفاظ على الخلايا أحادية النواة ووحدات CFU-GM بنسبة (96.8+5.7) و(89.6+22.6)% على التوالي. وتم تحديد كفاءة طريقة الصرف لجمع دم الحبل السري باستخدام حاوية Kompoplast-300 (روسيا). جمع الباحثون دم الحبل السري فور ولادة الطفل وانفصاله عن المشيمة، في ظروف وضع المشيمة داخل الرحم أو خارجه. قبل ثقب الوريد السري، عولج الحبل السري مرة واحدة بصبغة اليود 5٪، ثم مرتين بكحول إيثيلي 70٪. تدفق الدم تلقائيًا عبر أنابيب التوصيل إلى الحاوية. لم تستغرق عملية الجمع أكثر من 10 دقائق. كان متوسط حجم 66 عينة دم حبل سري تم جمعها عن طريق الصرف (72 + 28) مل، وكان عدد الكريات البيضاء في متوسط حجم العينة الإجمالي (1.1 + 0.6) × 107. عند تحليل دم الحبل السري للعقم (التلوث البكتيري، فيروس نقص المناعة البشرية 1، فيروس التهاب الكبد B و C، الزهري وعدوى الفيروس المضخم للخلايا)، تم الكشف عن أجسام مضادة IgG لفيروس التهاب الكبد C في عينة واحدة فقط. في دراسة أخرى، وُضعت المشيمة على سطح الجنين على إطار خاص فور الولادة، وعولج الحبل السري بمحلول اليود بنسبة 5% والكحول الإيثيلي بنسبة 75%. تم تصريف الوريد السري باستخدام إبرة من نظام نقل الدم (G16). تدفق الدم إلى الحاوية تلقائيًا. كان متوسط حجم الدم الذي تم جمعه بهذه الطريقة (55+25) مل. في عمل G. Kogler et al. (1996)، تم جمع دم الحبل السري باستخدام طريقة مغلقة وتم الحصول على كميات كبيرة من الدم - بمعدل (79+26) مل. لاحظ المؤلفون أنه من بين 574 عينة دم الحبل السري، احتوت حوالي 7% على أقل من 40 مل من الدم، مما لا يسمح باستخدامها في عملية الزرع. K. Isoyama et al. (1996)، بجمع دم الحبل السري عن طريق الضخ النشط باستخدام المحاقن، حصلوا على متوسط 69.1 مل من الدم (تراوح حجم دم الحبل السري بين 15 و135 مل). وأخيرًا، تمكن أ. عبد المجيد وآخرون (1997) من الحصول على متوسط 94 مل من دم الحبل السري (تراوح حجمه بين 56 و143 مل) من خلال قسطرة الوريد السري.

لتقليل خطر العدوى المنشأ طبيًا والتلوث بإفرازات الأم، طُوِّر نظام مغلق لجمع الدم، استنادًا إلى نظام نقل الدم واسع الاستخدام لشركة باكستر للرعاية الصحية، ديرفيلد، إلينوي (الولايات المتحدة الأمريكية)، ويحتوي على 62.5 مل من CPDA (سيترات-فوسفات-دكستروز مع أدينين) كمضاد للتخثر. تُعد تقنية الحصول على المادة ذات أهمية أساسية لإعداد عينة عالية الجودة من حيث الحجم والمحتوى ونقاء مُعلق الخلايا. من بين الطرق الحالية لجمع دم الحبل السري، والتي تُصنف تقليديًا إلى أنظمة مغلقة وشبه مفتوحة ومفتوحة، تُعطى الأفضلية للأولى، لأن النظام المغلق يقلل بشكل كبير من خطر التلوث الميكروبي للمادة، وكذلك تلوث مُعلق الخلايا بخلايا الأم.

أجرى أ. ناجلر وآخرون (1998) تحليلًا مقارنًا لكفاءة جميع الأنظمة الثلاثة لجمع دم الحبل السري. في المتغير الأول، تم إجراء الإجراء في نظام مغلق عن طريق تقشير الدم مباشرة في وعاء. في المتغير الثاني، تم الحصول على دم الحبل السري عن طريق الضخ النشط للدم باستخدام حقنة MP1 متبوعًا بغسل أوردة المشيمة والتصريف المتزامن للدم في وعاء (الطريقة المفتوحة). في المتغير الثالث، تم جمع الدم في نظام شبه مفتوح عن طريق استخراجه بنشاط باستخدام الحقن وغسله من خلال الشريان السري مع الضخ المتزامن في وعاء. في المتغير الأول، حصل المؤلفون على دم الحبل السري بحجم (76.4 + 32.1) مل مع محتوى كريات الدم البيضاء (10.5 + 3.6) × 10 ⁶ في 1 مل من الدم. في المتغير الثاني، كانت المؤشرات المقابلة (174.4+42.8) مل و(8.8+3.4) × 106 ^/ مل؛ وفي المتغير الثالث - (173.7+41.3) مل و(9.3+3.8) × 106 ^/ مل. لوحظت العدوى الأكثر شيوعًا في عينات دم الحبل السري عند استخدام نظام مفتوح. وُجد ارتباط مباشر بين كتلة المشيمة وحجم الدم المُستخرج - فكلما زادت كتلة المشيمة، زادت كمية الدم المُجمع.

بعد جمع دم الحبل السري، تأتي مرحلة الفصل - عزل الخلايا وحيدة النواة وتنقية مُعلّق الخلايا من كريات الدم الحمراء. في الظروف التجريبية، تُعزل الخلايا المُنْوَاة بالترسيب باستخدام ميثيل سلولوز أثناء تحلل كريات الدم الحمراء باستخدام كلوريد الأمونيوم. مع ذلك، لا ينبغي استخدام ميثيل سلولوز للأغراض السريرية، حيث تصل نسبة فقدان الخلايا الجذعية المُكَوِّنة للدم عليه إلى 50-90%. كما أن تحلل كريات الدم الحمراء نادرًا ما يُجرى في العيادة نظرًا للكميات الكبيرة من محلول العمل، على الرغم من أن نسبة عزل الخلايا المُنْوَاة ذات النمط الظاهري CD34+، بالإضافة إلى الخلايا السلفية ذات وظائف CFU-GM وCFU-GEMM بهذه الطريقة أعلى بكثير. وقد أُبلغ عن ظهور وسيلة جديدة لعزل الخلايا وحيدة النواة في تدرج الكثافة، وهي محلول كثافة بويانت (BDS72). تتميز هذه المادة بالخصائص الفسيولوجية التالية: الرقم الهيدروجيني - 7.4، والضغط الاسموزي - 280 ملي أسمول/كجم، والكثافة - 1.0720 جم/مل. ووفقًا للباحثين، يُمكن استخدامها لعزل ما يصل إلى 100% من الخلايا الإيجابية لـ CD34 وإزالة 98% من كريات الدم الحمراء. ومع ذلك، لم يُستخدم BDS72 في العيادات بعد.

في الطرق المعتمدة لعزل الخلايا النووية من دم الحبل السري، يُستخدم عادةً محلول نشا هيدروكسي إيثيل بنسبة 10% أو محلول جيلاتين بنسبة 3%. تكاد تكون كفاءة ترسيب كريات الدم الحمراء وعزل الخلايا النووية متساوية في كلتا الحالتين. ومع ذلك، عند استخدام الجيلاتين كعامل ترسيب، يُمكن الحصول على كمية أكبر قليلاً من وحدات CFU-GM مقارنةً باستخدام نشا هيدروكسي إيثيل. ويُفترض أن الاختلافات في كفاءة عزل وحدات CFU-GM ترجع إلى اختلاف معدلات ترسيب أجزاء الخلايا النووية، أو إلى قدرة جزيئات نشا هيدروكسي إيثيل على الامتصاص على سطح مستقبلات الخلايا المكونة للدم، وبالتالي حجب حساسيتها لعوامل تحفيز المستعمرات المستخدمة في زراعة وحدات CFU-GM في المختبر. ومع ذلك، قد يكون كلا المترسبين مناسبين لعزل الخلايا النووية عند إنشاء بنوك دم الحبل السري واسعة النطاق.

لا تختلف طرق فصل دم الحبل السري وحفظه بالتبريد اختلافًا جوهريًا عن تلك المستخدمة في العمل على الخلايا الجذعية المكونة للدم من الدم المحيطي ونخاع العظم لدى المتبرعين البالغين. ولكن عند تحضير كميات كبيرة من عينات دم الحبل السري للبنوك، يجب أن تكون طرق الفصل، في المقام الأول، منخفضة التكلفة. لذلك، وللأسف، تُستخدم حاليًا، لتلبية الاحتياجات السريرية، طرق روتينية مجربة لعزل خلايا دم الحبل السري وحفظها بالتبريد، بينما لا تزال طرق أكثر فعالية، وإن كانت باهظة الثمن، حكرًا على الباحثين.

بشكل عام، تم اعتماد معايير لتقييم عدد الخلايا المكونة للدم ومتطلبات فحص عينات دم الحبل السري لتحديد العوامل المعدية. ولضمان سلامة زراعة الخلايا المكونة للدم من دم الحبل السري، يجب فحص جميع عينات الدم بشكل أساسي للكشف عن الأمراض الوراثية والالتهابات المنقولة بالدم. ويوصي عدد من الباحثين بأساليب خاصة إضافية لفحص دم الحبل السري لتشخيص الأمراض الوراثية، مثل α-ثلاسيميا، وفقر الدم المنجلي، ونقص إنزيم الأدينوزين دياميناز، ونقص غاماغلوبولين الدم لبروتون، وداء هيرلر، وداء بونتر.

وفقًا لتوصيات ل. تيتشلي وزملائه (1998)، يجب فحص كل عينة من دم الحبل السري بحثًا عن الخلايا النووية، والخلايا الموجبة لـ CD34، وCFU-GM، واختبار مستضد الكريات البيضاء البشرية (HLA)، وتحديد فصيلة الدم وفقًا لفصيلة الدم ABO وعامل الريزوس (Rh). بالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء زراعة بكتيرية، واختبارات مصلية للكشف عن عدوى فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) وفيروس تضخم الخلايا، وHBsAg، والتهاب الكبد الفيروسي C، وفيروس HTLY-I وHTLV-II (ابيضاض الدم التائي البشري)، والزهري، وداء المقوسات. يُعد اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل إلزاميًا للكشف عن عدوى فيروس تضخم الخلايا وفيروس نقص المناعة البشرية.

يجب أن تُجرى عملية الحصول على دم الحبل السري وفقًا صارمًا لمبادئ الأخلاقيات الطبية الحيوية. قبل جمع الدم، من الضروري الحصول على موافقة المرأة الحامل على إجرائه. يُجرى حوار أولي مع المرأة الحامل للحصول على موافقتها المستنيرة على جميع الإجراءات، بدءًا من سحب الدم وحتى ملء الوثائق، من قِبل العاملين الطبيين فقط. لا يجوز بأي حال من الأحوال إجراء أي من هذه الإجراءات من قِبل أفراد ذوي تعليم بيولوجي أو كيميائي أو صيدلاني أو غير طبي، نظرًا لانتهاك المعايير الراسخة للأخلاقيات الحيوية وحقوق الإنسان. في حالة إيجابية اختبارات حمل المستضد السطحي لالتهاب الكبد الوبائي (HBsAg)، ووجود أجسام مضادة لمسببات التهاب الكبد الوبائي (C)، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV)، والزهري، لا يُجمع دم الحبل السري، وتُرفض عينات الدم التي جُمعت بالفعل وتُتلف. تجدر الإشارة إلى أن نقل العدوى الكامنة لدى الأطفال حديثي الولادة أقل شيوعًا بكثير من البالغين، وبالتالي فإن احتمالية النقل الدموي وتطور المضاعفات المعدية أثناء عمليات نقل خلايا الدم المكونة للدم من الحبل السري أقل بكثير من حالة استخدام نخاع العظم من متبرع بالغ لعملية الزرع.

يُعد تقييم زراعة الأعضاء من الجوانب المهمة للاستخدام السريري لدم الحبل السري، والذي يعتمد على تحديد كمية الخلايا الجذعية المكونة للدم في عينة دم الحبل السري وجرعات الخلايا اللازمة للزراعة. في الوقت الحالي، لم تُوضع معايير للكمية المثلى من خلايا دم الحبل السري اللازمة للزراعة. ولا توجد وجهة نظر متفق عليها عمومًا حتى فيما يتعلق بمعايير روتينية مثل عدد الخلايا الإيجابية لـ CD34 ووحدة CFU-GM. يُقيّم بعض الباحثين إمكانات الخلايا المكونة للدم من خلال تحليل المزارع طويلة الأمد مع تحديد محتوى وحدات تكوين المستعمرات الشائعة في الخلايا المحببة وكريات الدم الحمراء والوحيدات والنواءات - CFU-GEMM.

ومع ذلك، في الإطار السريري، يتضمن التقييم القياسي لعملية زرع دم الحبل السري عادةً تحديد عدد الخلايا النووية أو الوحيدة النواة فقط.

تخزين الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري

هناك أيضًا بعض المشاكل في تقنية تخزين الخلايا المكونة للدم من دم الحبل السري. عند حفظ الخلايا الجذعية المكونة للدم بالتبريد، وللوصول إلى وضع التجميد الأمثل، من الضروري تقليل حجم دم الحبل السري قدر الإمكان، وإزالة كريات الدم الحمراء مسبقًا لتجنب انحلال الدم وخطر حدوث تفاعل عدم توافق لمستضدات كريات الدم الحمراء (ABO، Rh). وتُعدّ طرق عزل الخلايا النووية المختلفة مناسبة لهذه الأغراض. في أوائل التسعينيات من القرن الماضي، كانت الطريقة الأكثر شيوعًا هي عزل الخلايا النووية بتدرج كثافة يعتمد على فيكول بكثافة 1.077 جم/مل أو بيركول بكثافة 1.080 جم/مل. إن فصل دم الحبل السري في تدرج الكثافة يسمح بعزل الخلايا أحادية النواة في الغالب، لكنه يؤدي إلى خسائر كبيرة في الخلايا السلفية المكونة للدم - ما يصل إلى 30-50٪.

تُقيّم كفاءة ترسيب نشا الهيدروكسي إيثيل في عملية عزل الخلايا المكونة للدم من دم الحبل السري بشكل مختلف. يشير بعض الباحثين إلى ضعف جودة الفصل باستخدام هذه الطريقة، بينما يُفضّل باحثون آخرون، على عكس ذلك، عزل الخلايا المكونة للدم من دم الحبل السري باستخدام محلول نشا الهيدروكسي إيثيل بتركيز 6%، من بين جميع الطرق الممكنة. في الوقت نفسه، تُؤكّد هذه الطريقة على الكفاءة العالية لترسيب الخلايا المكونة للدم، والتي تتراوح، وفقًا لبعض البيانات، بين 84% و90%.

يعتقد مؤيدو وجهة نظر مختلفة أن جميع طرق التجزئة تقريبًا مرتبطة بفقدان كبير للخلايا النووية، ويقترحون إجراء الفصل بالطرد المركزي، وتقسيم دم الحبل السري إلى ثلاثة أجزاء: كريات الدم الحمراء، وحلقة الكريات البيضاء، والبلازما. بعزل الخلايا بهذه الطريقة، وجد الباحثون أن محتوى الخلايا وحيدة النواة، وخلايا السلف المكونة للدم المبكرة، والخلايا ذات النمط المناعي CD34+ بلغ في النهاية 90%، و88%، و100% من المستوى الأولي، على التوالي. كما حصل باحثون آخرون على قيم مماثلة لزيادة خلايا دم الحبل السري المنقاة بهذه الطريقة: بعد الترسيب، تم عزل 92% من الخلايا النووية، و98% من الخلايا وحيدة النواة، و96% من الخلايا الإيجابية لـ CD34، و106% من وحدات تكوين المستعمرات.

في أواخر تسعينيات القرن الماضي، استُخدم الجيلاتين على نطاق واسع كعامل ترسيب. وفي الممارسة السريرية، استُخدم الجيلاتين لعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري منذ عام ١٩٩٤. وعند استخدام محلول الجيلاتين بتركيز ٣٪، تصل كفاءة عزل الخلايا النووية إلى ٨٨-٩٤٪. وقد أكد الاستخدام الواسع النطاق للجيلاتين في إنشاء بنك دم الحبل السري مزاياه مقارنةً بعوامل الترسيب الأخرى. وقد أثبت تحليل مقارن لكفاءة جميع الطرق المذكورة أعلاه لعزل الخلايا النووية في ظل ظروف استخدامها المتتالي على كل عينة من عينات دم الحبل السري المختبرة أن محلول الجيلاتين بتركيز ٣٪ هو عامل الترسيب الأمثل من حيث إنتاج الخلايا وحيدة النواة ذات النمط الظاهري CD34+/CD45+، وكذلك من حيث عدد وحدات CFU-GM وCFU-GEMM. كانت الطرق التي تستخدم تدرج كثافة فيكول، وكذلك استخدام نشا هيدروكسي إيثيل وميثيل السليلوز، أقل فعالية بشكل ملحوظ، حيث وصلت خسائر الخلايا المكونة للدم إلى 60٪.

لا يقتصر توسع عمليات زراعة الخلايا الجذعية لدم الحبل السري على تطوير أساليب الحصول عليها فحسب، بل يشمل أيضًا تخزينها. وتوجد العديد من المشكلات المرتبطة مباشرةً بإعداد دم الحبل السري للتخزين طويل الأمد واختيار التقنية الأمثل لحفظ عيناته بالتبريد. من بينها، إمكانية إجراء عمليات الفصل، واستخدام وسائط حفظ متنوعة بالتبريد، وتطبيق أساليب تحضير الخلايا المذابة للزرع. وغالبًا ما تُنقل عينات دم الحبل السري الأصلي من مناطق بعيدة عن مراكز أمراض الدم. وفي هذا الصدد، تبرز مشكلة فترات التخزين المقبولة لدم الحبل السري من لحظة الحصول عليه إلى بداية الحفظ بالتبريد، وهو أمر ذو أهمية خاصة عند إنشاء بنوك دم الحبل السري.

أظهرت دراسة للنشاط الوظيفي للخلايا المكونة للدم في دم الحبل السري بعد تخزين طويل الأمد (حتى 12 عامًا) في النيتروجين السائل أن حوالي 95٪ من الخلايا المكونة للدم لا تفقد قدرتها التكاثرية العالية خلال هذه الفترة. في عمل S. Yurasov والمؤلفين المشاركين (1997)، ثبت أن تخزين دم الحبل السري في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية) أو عند 4 درجات مئوية لمدة 24 و 48 ساعة لا يقلل بشكل كبير من قابلية الخلايا المكونة للدم للحياة، والتي تبلغ 92 و 88٪ من المستوى الأولي، على التوالي. ومع ذلك، إذا تم تمديد فترة التخزين إلى ثلاثة أيام، فإن عدد الخلايا النووية القابلة للحياة في دم الحبل السري ينخفض بشكل كبير. في الوقت نفسه، أظهرت دراسات أخرى أنه عند تخزينه لمدة 2-3 أيام عند 22 أو 4 درجات مئوية، فإن قابلية الخلايا المحببة الناضجة للحياة، وليس الخلايا المكونة للدم، تعاني في المقام الأول.

قد تتأثر قابلية بقاء الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري سلبًا بمكونات أنظمة جمع دم الحبل السري. كشف تحليل لتأثير مضادات التخثر المختلفة، التي تعتمد آلية عملها على ارتباط أيونات الكالسيوم (ACD، EDTA، XAPD-1) على الخلايا السلفية المكونة للدم في ظروف تخزين دم الحبل السري لمدة تتراوح بين 24 و72 ساعة، عن تأثيرها السلبي على قابلية بقاء الخلايا النووية. في هذا الصدد، يوصي الباحثون باستخدام محلول الفوسفات العازل (PBS) مع إضافة الهيبارين الطبيعي بدون مادة حافظة بتركيز 20 وحدة/مل، مما يسمح، في رأيهم، بزيادة مدة تخزين دم الحبل السري غير المجزأ إلى 72 ساعة ويحافظ على النشاط الوظيفي لوحدات تكوين المستعمرات. ومع ذلك، أظهرت دراسة حول سلامة CFU-GM وCFU-G أن مدة تخزين دم الحبل السري قبل التجميد يجب ألا تتجاوز تسع ساعات. ومن الواضح أن المبدأ الذي ينبغي تطبيقه في هذه الحالة هو أنه في حالة وجود بيانات متضاربة، يجب استخدام الحد الأدنى الموصى به لفترة التخزين لدم الحبل السري، ويجب البدء في تجميد الخلايا المعزولة بشكل مبرمج في أقرب وقت ممكن.

عند تجميد الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري، يُستخدم عادةً محلول DMSO بتركيز 10% كعامل حماية من التجميد. ومع ذلك، بالإضافة إلى تأثيره الوقائي الواضح، فإن ثنائي ميثيل سلفوكسيد بهذا التركيز له تأثير سام مباشر للخلايا، حتى مع أدنى تعرض لخلايا دم الحبل السري. لتقليل التأثير السام للخلايا لـ DMSO، تُستخدم درجة حرارة التعرض صفر، وتُسرع جميع عمليات المعالجة، وتُغسل عينات دم الحبل السري عدة مرات بعد إذابتها.

منذ عام ١٩٩٥، يُطوّر معهد أمراض الدم ونقل الدم التابع لأكاديمية العلوم الطبية في أوكرانيا توجهًا علميًا يهدف إلى دراسة شاملة لدم الحبل السري كمصدر بديل للخلايا الجذعية المكونة للدم. وعلى وجه الخصوص، طُوّرت تقنيات جديدة لحفظ الخلايا المكونة للدم من دم الحبل السري غير المجزأ والمجزأ بالتبريد في درجات حرارة منخفضة. ويُستخدم البولي فينيل بيروليدون الطبي منخفض الوزن الجزيئي كمادة واقية من التجميد. وتعتمد طريقة حفظ دم الحبل السري غير المجزأ بالتبريد على تقنية مبتكرة للتحضير المسبق للخلايا للتجميد، وطريقة خاصة لمعالجة مُعلّقات الخلايا قبل عملية الزرع مباشرةً.

من أهم العوامل المؤثرة على مستوى النشاط الوظيفي للخلايا الجذعية المكونة للدم المحفوظة بالتبريد سرعة تبريد مُعلق الخلايا، وخاصةً خلال مرحلة التبلور. يوفر النهج البرمجي لحل مشكلة سرعة ووقت التجميد فرصًا كبيرة لابتكار طرق حفظ بالتبريد بسيطة وفعالة للغاية، دون الحاجة إلى غسل مُعلق الخلايا من مواد الحماية بالتبريد قبل الزراعة.

أخطر مراحل تحضير الخلايا على حيويتها هي مرحلتا التجميد والذوبان المباشرين. عند تجميد الخلايا المكونة للدم، قد يتلف جزء كبير منها في لحظة انتقال الوسط الخلوي من الحالة السائلة إلى الحالة الصلبة - أي التبلور. لتقليل نسبة موت الخلايا، تُستخدم مواد واقية من التجميد، وقد غطت المؤلفات العلمية آليات عملها وفعاليتها الوقائية بشكل كافٍ.

إن الاتجاه الواعد لتحسين طرق الحفظ بالتبريد لنخاع العظم وخلايا دم الحبل السري هو الجمع بين تركيزات منخفضة من العديد من المواد الواقية بالتبريد ذات آليات العمل المختلفة في محلول واحد، على سبيل المثال، DMSO الذي يعمل على المستوى داخل الخلايا وهيدروكسي إيثيل النشا أو الألبومين، والتي لها تأثير وقائي خارج الخلية.

لحفظ خلايا دم الحبل السري بالتبريد، يُستخدم محلول DMSO بتركيز 20%، ويُسكب ببطء في مُعلق الخلايا مع التحريك الميكانيكي المستمر في حمام جليدي حتى تصل نسبة المادة الواقية من التجمد وحجم مُعلق الخلايا إلى نسبة متساوية (1:1). ويكون التركيز النهائي لثنائي ميثيل سلفوكسيد 10%. يُبرّد مُعلق الخلايا بعد ذلك في وحدة تبريد مُبرمجة بمعدل GS/min إلى -40 درجة مئوية، ثم يُزاد معدل التبريد إلى 10 درجات مئوية/دقيقة. بعد الوصول إلى -100 درجة مئوية، يُوضع وعاء مُعلق الخلايا في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية). باستخدام تقنية الحفظ بالتبريد هذه، يصل حفظ الخلايا وحيدة النواة النشطة وظيفيًا بعد إذابة الجليد إلى 85% من مستواها الأصلي.

تهدف تعديلات طرق الحفظ بالتبريد إلى تقليل تركيز ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) بإضافة نشا هيدروكسي إيثيل (التركيزات النهائية لثنائي ميثيل سلفوكسيد وهيدروكسي إيثيل نشا هي 5% و6% على التوالي). لوحظت كفاءة عالية لهذا المزيج من المواد الواقية بالتبريد عند تجميد معلق الخلايا النخاعية، مع حماية خلوية لا تقل عن تلك المستخدمة عند استخدام محلول ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيز 10% فقط. بلغ عدد الخلايا النووية الحية 96.7% من مستواها الأولي، وبلغ نشاطها الوظيفي، المُقدر بعدد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU-GM)، 81.8%.

عند استخدام محلول ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيزات تتراوح بين 5 و10% مع 4% من نشا هيدروكسي إيثيل (التركيز النهائي)، وُجد أن سلامة الخلايا الإيجابية لـ CD34 في هذه النطاقات من ثنائي ميثيل سلفوكسيد تظل شبه ثابتة. في الوقت نفسه، عند انخفاض تركيز ثنائي ميثيل سلفوكسيد من 5 إلى 2.5%، يُلاحظ موتٌ هائل لخلايا دم الحبل السري - حيث ينخفض عدد الوحدات الخلوية القابلة للحياة من 85.4% إلى 12.2%. كما توصل باحثون آخرون إلى أن محاليل ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيزات 5 و10% (وفقًا لنسخة المؤلف - مع مصل ذاتي) هي التي توفر الحماية الخلوية بأقصى فعالية أثناء الحفظ بالتبريد لخلايا دم الحبل السري الجذعية المكونة للدم. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت نسبة حفظ عالية للخلايا المجمدة والمذابة على التوالي عند استخدام مزيج من محلول ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيز 5 أو 10% مع محلول نشا هيدروكسي إيثيل بتركيز 4%، خاصةً عند معدل تبريد مُتحكم به يبلغ GS/min. في دراسة أخرى، استُخدم محلول واقٍ من التجمد يتكون من ثلاثة مكونات: DMSO، وألبومين بشري مُنقّى، ووسط RPMI بنسبة 1:4:5، والذي أُضيف إلى مُعلق الخلايا بنسبة حجمية متساوية (كان التركيز النهائي لثنائي ميثيل سلفوكسيد 5%). بعد إذابة التجميد في حمام مائي عند درجة حرارة +4 GS، تجاوزت نسبة حفظ CFU-GM 94%.

يقترح بعض الباحثين استخدام دم الحبل السري غير المجزأ للحفظ بالتبريد، نظرًا لفقدان كميات كبيرة من الخلايا المكونة للدم أثناء عملية إزالة خلايا الدم الحمراء. في هذه الطريقة، يُستخدم محلول ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيز 10% لحماية الخلايا وحيدة النواة من الآثار الضارة للتبلور بالتبريد. يُجرى التجميد بمعدل تبريد ثابت يبلغ GS/min حتى -80 درجة مئوية، وبعد ذلك يُخفض مُعلق خلايا دم الحبل السري إلى نيتروجين سائل. تُؤدي طريقة التجميد هذه إلى تحلل جزئي لخلايا الدم الحمراء، لذا لا تتطلب عينات الدم التجزئة. بعد إذابة التجميد، يُغسل مُعلق الخلايا من الهيموغلوبين الحر وثنائي ميثيل سلفوكسيد في محلول من ألبومين بشري أو في مصل دم المريض الذاتي، ويُستخدم في عملية الزرع.

إن حفظ الخلايا السلفية المكونة للدم بعد إذابة دم الحبل السري غير المجزأ أعلى بالفعل من حفظ دم الحبل السري المجزأ. ومع ذلك، نظرًا لثبات بعض كريات الدم الحمراء في التجميد، فقد تنشأ مشاكل خطيرة بعد نقل الدم نتيجة نقل كريات الدم الحمراء غير المتوافقة مع فصيلة الدم ABO. بالإضافة إلى ذلك، يزداد حجم الدم غير المجزأ المخزن بشكل ملحوظ. من الناحية السريرية، لا يزال الحفظ بالتبريد لخلايا دم الحبل السري المكونة للدم المعزولة والمنقاة سابقًا من أجزاء خلوية أخرى هو الخيار الأمثل.

على وجه الخصوص، طُوِّرت طريقةٌ لحفظ خلايا دم الحبل السري المُجزَّأة بالتبريد، مما يسمح بإزالة كريات الدم الحمراء في مرحلة التحضير للتجميد، حيث يُستخدم محلول هيدروكسي إيثيل النشا بتركيز 6% كجزءٍ من محلول استبدال البلازما "ستابيزول". بعد إذابة التجميد، يصبح مُعلَّق الخلايا المُنتَج بهذه الطريقة جاهزًا للاستخدام السريري دون أي تدخلات إضافية.

لذلك، تتوافر حاليًا العديد من الطرق الفعالة لحفظ دم الحبل السري بالتبريد. يكمن الفرق الأساسي بينها في تجميد عينات الدم دون تجزئة، أو فصلها إلى خلايا مجزأة في مرحلة التحضير، وتحضير خلايا نووية خالية من كريات الدم الحمراء.

زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري

في أواخر الثمانينيات وأوائل التسعينيات، ثبت أن دم الحبل السري، الذي يوفر للجنين الدعم الحيوي أثناء الحمل، يحتوي على نسبة عالية من الخلايا الجذعية المكونة للدم. وقد ساهم البساطة النسبية للحصول على خلايا دم الحبل السري وغياب المشكلات الأخلاقية الواضحة في استخدام خلايا دم الحبل السري الجذعية في الطب العملي. وكانت أول عملية زرع ناجحة لدم الحبل السري لطفل مصاب بفقر الدم فانكوني بمثابة نقطة انطلاق لتوسيع نطاق عمليات زرع خلايا دم الحبل السري الجذعية وإنشاء نظام لبنوكها. وفي النظام العالمي لبنوك دم الحبل السري، يُعد مركز نيويورك للدم المشيمي، وهو مدرج في الميزانية العمومية للمعهد الوطني الأمريكي للصحة، أكبرها. ويقترب عدد عينات دم الحبل السري المخزنة في هذا البنك من 20,000 عينة. كما يتزايد عدد المتلقين (معظمهم من الأطفال) الذين خضعوا لعملية زرع ناجحة. وبحسب وزارة الصحة الأمريكية، فإن فترة الحياة الخالية من الانتكاس بعد عملية زرع الأعضاء لمتلقي زراعة دم الحبل السري تتجاوز بالفعل 10 سنوات.

هذا ليس مفاجئًا، إذ أظهرت دراسات عديدة حول القدرة على تكوين الدم لدم الحبل السري أن الخلايا الجذعية المبكرة، من حيث الكمية والجودة، ليست أقل جودة من نخاع العظم لدى البالغين فحسب، بل تتفوق عليه في بعض النواحي. وتعود القدرة التكاثرية العالية لخلايا دم الحبل السري إلى الخصائص التكوينية للإشارات الخلوية، ووجود مستقبلات لعوامل نمو محددة على الخلايا الجذعية المكونة للدم، وقدرة خلايا دم الحبل السري على إنتاج عوامل النمو ذاتيًا، وكبر حجم وطول التيلوميرات.

وبالتالي، فإن الخصائص الجينومية والظاهرية لخلايا الدم الجذعية المكونة للدم في الحبل السري تحدد مسبقًا إمكانية زرع الخلايا عالية الجودة مع إمكانية عالية لاستعادة تكوين الدم لدى المتبرع في جسم المتلقي.

فوائد الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري

من بين المزايا الحقيقية لاستخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري في عمليات الزرع مقارنةً بمصادر أخرى للخلايا المكونة للدم، تجدر الإشارة إلى انعدام المخاطر على صحة المتبرع تقريبًا (إذا استثنينا المشيمة) وعدم الحاجة إلى التخدير العام. يُوسّع استخدام دم الحبل السري من احتمالات زراعة الخلايا بفضل عمليات الزرع المتوافقة جزئيًا مع مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA) (عدم التوافق من مستضد واحد إلى ثلاثة مستضدات). وقد طُوّرت طريقة للتخزين طويل الأمد لخلايا دم الحبل السري المكونة للدم في حالة تجميد، مما يزيد من احتمالية الحصول على أنواع نادرة من مستضدات الكريات البيضاء البشرية، ويُقلّل من وقت البحث عن عملية زرع متوافقة مع مستضد الكريات البيضاء البشرية لإجراء عملية زرع خيفي. في الوقت نفسه، ينخفض خطر الإصابة ببعض أنواع العدوى الكامنة التي تنتقل عبر وسائل معدية بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك، يُتيح استخدام خلايا دم الحبل السري في عمليات الزرع الذاتية شكلاً غير مكلف من أشكال التأمين البيولوجي على الحياة.

ومع ذلك، ونظراً لصغر حجم الدم الذي يمكن جمعه من المشيمة (لا يزيد في المتوسط عن 100 مل)، فإن مشكلة الحصول على أقصى كمية ممكنة من الدم من وريد الحبل السري تبرز إلى الواجهة مع مراعاة حالة الحد الأدنى من خطر التلوث البكتيري لعينات دم الحبل السري التي تم الحصول عليها.

عادةً ما يتم تحديد الخلايا المكونة للدم البدائية لدم الحبل السري من خلال وجود جليكوفوسفوبروتين CD34 على سطحها، وكذلك بناءً على خصائصها الوظيفية من خلال دراسة الاستنساخ أو تكوين المستعمرات في المختبر. أظهر التحليل المقارن أن الحد الأقصى لمحتوى الخلايا الموجبة لـ CD34 في الجزء وحيد النواة في دم الحبل السري ونخاع العظم هو 1.6% و5.0% على التوالي، وأن الحد الأقصى لمستوى وحدات تكوين المستعمرات في المجموعة الفرعية لخلايا CD34+ هو 80% و25%، وأن كفاءة الاستنساخ الكلية لخلايا CD34+ هي 88% و58%، وأن الحد الأقصى لمحتوى الخلايا المكونة للمستعمرات ذات القدرة العالية على التكاثر (HPP-CFC في المجموعة الفرعية CD34+) هو 50% و6.5%. تجدر الإشارة إلى أن كفاءة استنساخ خلايا CD34+ وCD38 والقدرة على الاستجابة لتحفيز السيتوكين أعلى أيضًا في الخلايا الجذعية المكونة للدم في دم الحبل السري.

يؤكد الجمع بين المستضدات الظاهرية Thy-1 وCD34 وCD45RA القدرة التكاثرية العالية لخلايا دم الحبل السري المكونة للدم، ويشير التعبير عن هذه المستضدات الثلاثة على سطح خلايا دم الحبل السري إلى انتمائها إلى الخلايا الجذعية. بالإضافة إلى ذلك، وُجد أن دم الحبل السري يحتوي على خلايا ذات النمط الظاهري CD34+ لا تحمل علامات تمايز خطي. تبلغ نسبة المجموعات الفرعية الخلوية ذات النمط الظاهري CD34+/Lin في دم الحبل السري حوالي 1% من إجمالي عدد الخلايا الإيجابية لـ CD34. تُنتج الخلايا السلفية المكونة للدم في دم الحبل السري كلاً من سلالة الخلايا اللمفاوية وسلسلة الخلايا النخاعية متعددة القدرات ذات التمايز الخطي للخلايا، مما يشير أيضًا إلى انتمائها إلى الخلايا الجذعية.

كما ذُكر سابقًا، تكمن الاختلافات الجوهرية بين نخاع العظم ودم الحبل السري في كمية الخلايا المكونة للدم المستخدمة في عملية الزرع، والتي يتم الحصول عليها خلال عملية جمع واحدة. إذا كان فقدان كتلة الخلايا أثناء عملية زرع نخاع العظم مقبولًا بنسبة تتراوح بين 40% و50% أثناء الفصل والتجميد والذوبان والاختبار، فإن هذا الفقد في الخلايا في دم الحبل السري يكون كبيرًا جدًا، لأنه في حال استخدام كمية غير كافية من الخلايا الجذعية المكونة للدم، فقد يثبت عدم فعالية عملية الزرع. ووفقًا لـ G. Kogler وآخرون (1998)، بالنسبة لزرع الخلايا بوزن جسم متلقي يبلغ 10 كجم، يمكن أن تكون جميع عينات دم الحبل السري عمليات زرع محتملة (يبلغ إجمالي عدد عينات دم الحبل السري المجمعة 2098 عينة)، بوزن جسم يبلغ 35 كجم - أي ما يعادل 67%، ويمكن أن توفر 25% فقط من العينات عملية زرع فعالة للمرضى الذين تتراوح أوزانهم بين 50 و70 كجم. يشير هذا الوضع السريري إلى الحاجة إلى تحسين كفاءة الطرق الحالية لجمع خلايا دم الحبل السري وإنتاجها وتخزينها. لذلك، يناقش الأدب حاليًا على نطاق واسع قضايا توحيد طرق جمع واختبار وفصل وحفظ دم الحبل السري لإنشاء بنوك الدم واستخدامه في العيادة، وينص أيضًا على شروط وأحكام تخزين الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري.

[ 7 ]، [ 8 ]، [ 9 ]

استخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري في الطب

^{عادةً، يُمكن عزل ما يصل إلى 10 6} خلايا جذعية مُكوِّنة للدم من دم الحبل السري، ونادرًا ما تكون أكثر. وفي هذا الصدد، لا يزال السؤال حول ما إذا كانت هذه الكمية من الخلايا المُكوِّنة للدم من دم الحبل السري كافية لاستعادة تكون الدم لدى مُستقبِل بالغ مفتوحًا حتى يومنا هذا. الآراء مُنقسمة حول هذا الموضوع. يعتقد بعض الباحثين أن هذه الكمية كافية تمامًا لزراعة الأعضاء لدى الأطفال، ولكنها قليلة جدًا لزراعة الأعضاء لدى البالغين، حيث تتمثل الكمية المُثلى لهم في إدخال (7-10) × 10 ⁶ خلايا إيجابية لـ CD34 لكل 1 كجم من وزن الجسم - بمعدل 7 × 10 ⁸ لكل عملية زراعة. ويترتب على هذه الحسابات أن عينة واحدة من دم الحبل السري تحتوي على خلايا جذعية مُكوِّنة للدم أقل بـ 700 مرة مما هو مطلوب لعملية زراعة واحدة لمريض بالغ. ومع ذلك، يتم إجراء هذا التقييم الكمي عن طريق القياس على عدد خلايا نخاع العظم المنقولة ولا يأخذ في الاعتبار السمات التكوينية لعملية تكون الدم على الإطلاق.

على وجه الخصوص، يتم تجاهل حقيقة ارتفاع القدرة التكاثرية لخلايا دم الحبل السري الجذعية المكونة للدم مقارنةً بخلايا الدم السلفية المكونة للدم من نخاع العظم. تشير نتائج دراسات إمكانية تكوين المستعمرات في المختبر إلى أن جرعة واحدة من دم الحبل السري قادرة على إعادة تكوين خلايا الدم لدى المتلقي البالغ. من ناحية أخرى، لا ينبغي إغفال أن عدد خلايا دم الحبل السري الجذعية يتناقص حتى أثناء التطور الجنيني: إذ يتناقص محتوى الخلايا الإيجابية لـ CD34 في دم الحبل السري خطيًا بمقدار 5 مرات في الفترة من 20 أسبوعًا (تم الحصول على الدم المستخدم في الدراسة أثناء إنهاء الحمل المبكر) إلى 40 أسبوعًا من الحمل (فترة المخاض الفسيولوجي)، ويصاحب ذلك زيادة متوازية ودائمة في التعبير عن علامات التمايز الخلوي الخطي.

نظراً لعدم وجود نهج موحد لتحديد كمية الخلايا السلفية في عينات دم الحبل السري، لا يزال الجدل قائماً حول الجرعة المثلى من الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري. يعتقد بعض الباحثين أن عدد الخلايا النووية والخلايا وحيدة النواة، المُعاد حسابها لوزن جسم المتلقي، أي جرعتها، يمكن أن يُستخدم كمعيار لاختيار عينات دم الحبل السري. ويعتقد بعض الباحثين أن الحد الأدنى للعتبة الكمية لخلايا CD34+، حتى في حالة زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم ذاتياً، هو 2 × 10 ⁶ /كجم. في الوقت نفسه، فإن زيادة جرعة الخلايا المكونة للدم إلى 5 × 10 ⁶ /كجم (أي 2.5 مرة فقط) تضمن مساراً أفضل في الفترة المبكرة بعد الزرع، وتُقلل من حدوث المضاعفات المعدية، وتُقصر مدة العلاج الوقائي بالمضادات الحيوية.

وفقًا لـ E. Gluckman et al. (1998)، في علم الأورام الدموية، فإن شرط نجاح عملية زرع خلايا دم الحبل السري هو إدخال ما لا يقل عن 3.7 × 10 ⁷ خلية نووية لكل 1 كجم من وزن جسم المتلقي. عندما يتم تقليل جرعة الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى 1 × 10 ⁷ أو أقل من الخلايا النووية لكل 1 كجم من وزن جسم المريض، فإن خطر فشل عملية الزرع وانتكاس سرطان الدم يزداد بشكل حاد. يجب إدراك أن الحد الأدنى لعدد الخلايا السلفية اللازمة لاستعادة تكوين الدم بسرعة بعد زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم لا يزال غير معروف. من الناحية النظرية، يمكن تحقيق ذلك باستخدام خلية واحدة، ولكن في الممارسة السريرية لزراعة نخاع العظم، يتم ضمان الزرع السريع والمستقر عن طريق نقل ما لا يقل عن (1-3) × 10 ⁸ خلية نووية لكل 1 كجم من وزن جسم المريض.

تضمنت دراسة مفصلة حديثة لتحديد العدد الأمثل للخلايا الجذعية المكونة للدم في علم الأورام الدموية مراقبة المرضى في ثلاث مجموعات، تم تخصيصها بناءً على محتوى الخلايا الإيجابية لـ CD34 في المادة المزروعة. تم إعطاء مرضى المجموعة الأولى (3-5) × 10 ⁶ خلايا / كجم. كانت جرعة الخلايا الجذعية المكونة للدم في مرضى المجموعة الثانية (5-10) × 10 ⁶ خلايا / كجم، وتم زرع مرضى المجموعة الثالثة بأكثر من 10 × 10 ⁶ خلايا CD34 + / كجم. لوحظت أفضل النتائج في مجموعة المتلقين الذين تلقوا عملية زرع بعدد خلايا إيجابية لـ CD34 يساوي (3-5) × 10 ⁶ / كجم. مع زيادة جرعة الخلايا المزروعة فوق 5 × 10 ⁶ / كجم، لم يتم الكشف عن مزايا ذات دلالة إحصائية. في هذه الحالة، يرتبط ارتفاع نسبة الخلايا الجذعية المكونة للدم في عملية الزرع (>10 × 106 ^/ كجم) بإعادة ضخ عدد كبير من خلايا الورم المتبقية، مما يؤدي إلى انتكاس المرض. لم تُثبت علاقة مباشرة بين عدد الخلايا السلفية الخيفية المزروعة وتطور تفاعل الطعم مع المضيف.

تؤكد الخبرة العالمية المتراكمة في زراعة دم الحبل السري قدرتها العالية على إعادة التكاثر. يرتبط معدل زراعة دم الحبل السري بعدد الخلايا النووية المُدخلة. تُلاحظ أفضل النتائج عند زراعة 3 × 10 ⁷ /كجم، بينما تبلغ هذه الجرعة لنخاع العظم 2 × 10 ⁸ /كجم. ووفقًا لبيانات مراكز التنسيق، أُجريت 1200 عملية زراعة لخلايا دم الحبل السري حول العالم بنهاية عام 2000، معظمها من متبرعين أقارب (83%). من البديهي أنه ينبغي اعتبار دم الحبل السري بديلاً عن نخاع العظم لزراعته لدى مرضى داء أرومة الدم.

في الوقت نفسه، تُثير طبيعة مصدر الأنسجة المكونة للدم من الحبل السري حديثي الولادة تفاؤلاً نظرًا لوجود خصائص وظيفية في الخلايا الجذعية المكونة للدم. في الوقت نفسه، لا يُمكن الإجابة على سؤال مدى كفاية عينة دم واحدة من الحبل السري لاستعادة تكوين الدم لدى متلقي بالغ مصاب بخلل تنسج الدم إلا من خلال الخبرة السريرية. يُستخدم زرع خلايا دم الحبل السري في برامج علاج العديد من الأمراض الورمية وغير الورمية: سرطان الدم ومتلازمات خلل التنسج النقوي، وسرطان الغدد الليمفاوية غير هودجكين وورم الخلايا البدائية العصبية، وفقر الدم اللاتنسجي، وفقر الدم الخلقي فانكوني ودايموند-بلاكفان، ونقص التصاق كريات الدم البيضاء، ومتلازمة بار، ومرض غونتر، ومتلازمة هيرلر، والثلاسيميا.

تستحق الجوانب المناعية لزراعة الخلايا المكونة للدم من دم الحبل السري اهتمامًا بالغًا ودراسةً منفصلة. وقد تبيّن أن نتائج زراعة الخلايا الجذعية من دم الحبل السري من متبرعين غير مكتملي التوافق مع مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA)، مُرضية للغاية، مما يشير، وفقًا للباحثين، إلى انخفاض التفاعل المناعي لخلايا دم الحبل السري مقارنةً بنخاع العظم.

كشفت دراسة مُفصّلة للتركيب الخلوي لدم الحبل السري عن خصائص كلٍّ من الطيف الظاهري للخلايا المُفعّلة في الجهاز المناعي ونشاطها الوظيفي، مما أتاح اعتبار دم الحبل السري مصدرًا للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) مع خطر منخفض نسبيًا لحدوث تفاعل "الطعم تجاه المُضيف". من بين علامات عدم النضج الوظيفي للخلايا الكفؤة مناعيًا في دم الحبل السري، من الضروري ملاحظة اختلال التوازن في إنتاج السيتوكينات وانخفاض حساسية الاستجابة المناعية لتنظيم السيتوكينات. يُعتبر تثبيط نشاط الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا الناتج عن ذلك عاملًا يُساهم في تكوين التسامح المناعي تجاه أنسجة الدم المزروعة. في مجموعة الخلايا الليمفاوية من دم الحبل السري، وعلى عكس الدم المحيطي ونخاع العظم لدى المتبرعين البالغين، تسود الخلايا الليمفاوية غير النشطة وغير الناضجة والخلايا الكابتة. وهذا يُشير إلى انخفاض جاهزية الخلايا الليمفاوية التائية في دم الحبل السري للاستجابة المناعية. من السمات المهمة لمجموعات الخلايا الوحيدة في دم الحبل السري هو انخفاض محتوى الخلايا العاملة النشطة والمقدمة للمستضد.

من جهة، يُوسّع انخفاض نضج الخلايا المؤثرة في الجهاز المناعي في دم الحبل السري من نطاق استخدام هذا الدم في العيادات، إذ تُخفّف هذه الخصائص من حدة الصراع المناعي بين خلايا المتبرع والمتلقي. من جهة أخرى، من المعروف وجود علاقة بين درجة تطور تفاعل "الطُعم ضد المُضيف" وتأثير الزرع المضاد للأورام، أي تطور تأثير "الطُعم ضد سرطان الدم". في هذا الصدد، أُجريت دراسة حول السمية الخلوية المضادة للأورام لخلايا دم الحبل السري. تشير النتائج إلى أنه على الرغم من ضعف استجابة خلايا دم الحبل السري المناعية لتحفيز المستضد، فإن الخلايا الليمفاوية المُنشّطة بشكل أساسي هي خلايا قاتلة طبيعية وخلايا شبيهة بالخلايا القاتلة، والتي تلعب دورًا فعالًا في آليات تحقيق السمية الخلوية المضادة للأورام. بالإضافة إلى ذلك، عُثر في دم الحبل السري على مجموعات فرعية من الخلايا الليمفاوية ذات النمطين الظاهريين CD16+CD56+ وCD16"TCRa/p+. ويُفترض أن هذه الخلايا في شكلها النشط تُنفّذ تفاعل "الطعم مقابل سرطان الدم".

في معهد الأورام التابع لأكاديمية العلوم الطبية في أوكرانيا، أُعطيت خلايا دم الحبل السري المحفوظة بالتبريد لمرضى السرطان الذين يعانون من نقص تنسج الدم المستمر نتيجة العلاج الكيميائي والإشعاعي. وقد أعادت زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري بفعالية كبيرة عملية تكوين الدم الضعيفة لدى هؤلاء المرضى، كما يتضح من الزيادة المستمرة في محتوى العناصر المتكونة الناضجة في الدم المحيطي، بالإضافة إلى زيادة المؤشرات التي تميز حالة المناعة الخلوية والخلطية. ويسمح استقرار تأثير إعادة التكاثر بعد زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري بمواصلة العلاج الإشعاعي والكيميائي دون انقطاع مسار العلاج. وتشير المعلومات إلى زيادة فعالية زراعة الخلايا الجذعية من دم الحبل السري لدى مرضى الأورام الدموية: حيث بلغ الخطر السنوي لانتكاس مرض الورم عند استخدامها 25% مقابل 40% لدى المرضى الذين خضعوا لزراعة نخاع عظمي متماثل.

ينبغي اعتبار آلية عمل الخلايا الجذعية لدم الحبل السري المحفوظة بالتبريد نتيجةً للتحفيز الخلطي لتكوين الدم لدى المتلقي، الناتج عن القدرة الفريدة للخلايا الوليدية على إنتاج عوامل نمو الدم ذاتيًا، بالإضافة إلى الزرع المؤقت لخلايا المتبرع (كما يتضح من زيادة ملحوظة في محتوى الهيموغلوبين الجنيني في الدم المحيطي للمتلقيين في الفترة من اليوم السابع إلى الخامس عشر بعد نقل الدم مقارنةً بالبيانات الأولية). ويعود غياب ردود الفعل بعد نقل الدم لدى متلقي دم الحبل السري إلى التحمل النسبي لخلاياه المناعية، بالإضافة إلى كونه معيار ثقة للكفاية البيولوجية للمادة المحفوظة بالتبريد.

الخلايا السلفية القاتلة للخلايا اللمفاوية التائية من دم الحبل السري قادرة على التنشيط تحت تأثير تحفيز السيتوكين الخارجي، والذي يُستخدم لتطوير أساليب جديدة، سواءً داخل الجسم الحي أو خارجه، لتحفيز السمية الخلوية المضادة للأورام لعناصر اللمفاويات المزروعة، وذلك لاستخدامها لاحقًا في العلاج المناعي. إضافةً إلى ذلك، فإن عدم نضج جينوم خلايا دم الحبل السري المناعية يسمح باستخدامها لتعزيز النشاط المضاد للأورام باستخدام أساليب النمذجة الجزيئية.

اليوم، يُستخدم دم الحبل السري على نطاق واسع، لا سيما في أمراض الدم لدى الأطفال. ففي الأطفال المصابين بسرطان الدم الحاد، تُقلل عملية زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري، مقارنةً بزراعة نخاع العظم، من حدوث داء الطعم ضد المضيف بشكل ملحوظ. ومع ذلك، يترافق ذلك مع فترة أطول من نقص العدلات والصفيحات الدموية، وللأسف، ارتفاع في معدل الوفيات بعد 100 يوم من الزرع. قد يُعزى ازدياد فترة تعافي مستويات الخلايا المحببة والصفائح الدموية في الدم المحيطي إلى عدم كفاية تمايز المجموعات الفرعية الفردية من خلايا دم الحبل السري الموجبة لـ CD34، كما يتضح من انخفاض مستوى امتصاص الرودامين المشع وانخفاض التعبير عن مستضدات CD38 على سطحها.

في الوقت نفسه، أظهرت عملية زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري لمرضى بالغين، والتي أُجريت نظرًا لعدم وجود متبرع متوافق بنخاع العظم من غير الأقارب وإمكانية تعبئة الخلايا الجذعية المكونة للدم الذاتية، ارتفاعًا في معدل البقاء على قيد الحياة لمدة عام واحد دون انتكاسة لدى مجموعة المرضى الذين تقل أعمارهم عن 30 عامًا (73%). وأدى توسيع الفئة العمرية للمتلقين (18-46 عامًا) إلى انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة إلى 53%.

أظهر التحليل الكمي للخلايا ذات النمط الظاهري CD34+ في نخاع العظم ودم الحبل السري ارتفاعًا في محتواها (3.5 أضعاف) في نخاع العظم، ولكن لوحظت غلبة ملحوظة للخلايا ذات النمط الظاهري CD34+HLA-DR في دم الحبل السري. من المعروف أن خلايا الدم ذات العلامات المناعية CD34+HLA-DR تتكاثر بنشاط أكبر من الخلايا ذات النمط الظاهري المناعي CD34+HLA-DR+، وهو ما أكدته الدراسات التجريبية لنمو مزارع الخلايا المكونة للدم طويلة الأمد في المختبر. توجد أسلاف الخلايا البدائية ذات النمط الظاهري CD34+CD38 في كل من دم الحبل السري ونخاع العظم، ولكن خلايا دم الحبل السري ذات مجموعة العلامات CD34+CD38 تتمتع بنشاط استنساخي أعلى من الخلايا المكونة للدم من نفس النمط الظاهري المعزولة من نخاع عظم متبرعين بالغين. بالإضافة إلى ذلك، تتكاثر خلايا الدم الحبل السري ذات النمط المناعي CD34+CD38 بشكل أسرع استجابة لتحفيز السيتوكين (IL-3، IL-6، G-CSF) وتنتج مستعمرات أكثر بـ 7 مرات في الثقافات طويلة الأمد من خلايا نخاع العظم.

بنوك الخلايا الجذعية لدم الحبل السري

لتطوير مجال جديد من الطب العملي، ألا وهو زراعة الخلايا الجذعية من دم الحبل السري، ولإجراء عمليات زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم من نخاع العظم، لا بد من وجود شبكة واسعة من بنوك الدم، والتي أُنشئت بالفعل في الولايات المتحدة الأمريكية وأوروبا. وتُوحد جمعية Netcord Bank Association شبكات بنوك دم الحبل السري المحلية. وتتحدد أهمية إنشاء جمعية دولية لبنوك دم الحبل السري بالحاجة إلى عدد كبير من عينات دم الحبل السري ذات الفصيلة الواحدة لإجراء عمليات زراعة غير مرتبطة، مما يسمح باختيار متبرع مطابق لمستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA). ولا يمكن حل مشكلة العثور على المتبرع المناسب إلا بإنشاء نظام بنوك لتخزين عينات الدم من مختلف أنواع مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA). ويتطلب تنظيم نظام بنوك دم الحبل السري هذا تطويرًا أوليًا للمعايير الأخلاقية والقانونية، التي تُناقش حاليًا على المستوى الدولي.

من أجل إنشاء بنوك دم الحبل السري في أوكرانيا، يجب وضع سلسلة كاملة من اللوائح والوثائق.

أولاً، تتعلق هذه القضايا بتوحيد أساليب جمع دم الحبل السري وتجزئته وتجميده. من الضروري تنظيم قواعد جمع دم الحبل السري في مستشفيات الولادة بما يتوافق مع متطلبات أخلاقيات الطب، وذلك لتحديد الحد الأدنى لكمية دم الحبل السري اللازمة لنجاح عملية الزرع. كما يجب مقارنة وتوحيد معايير مختلفة لتقييم جودة وكمية الخلايا السلفية المكونة للدم، بالإضافة إلى أساليب تحديد مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA) وطرق تشخيص الأمراض الوراثية والمعدية التي قد تنتقل أثناء نقل خلايا دم الحبل السري، وذلك لوضع معايير مشتركة لاختيار المتبرعين الأصحاء. كما يجدر مناقشة إنشاء مرافق تخزين منفصلة للمصل والخلايا والحمض النووي (DNA) المأخوذ من دم الحبل السري.

من الضروري للغاية تنظيم شبكة حاسوبية لبيانات دم الحبل السري لربطها بسجلات متبرعي نخاع العظم. وللمضي قدمًا في تطوير زراعة الخلايا، من الضروري وضع بروتوكولات خاصة لمقارنة نتائج زراعة دم الحبل السري ونخاع العظم من أقارب متطابقي مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA) ومتبرعين غير مرتبطين. إن توحيد الوثائق، بما في ذلك الموافقة المستنيرة من الوالدين، بالإضافة إلى إخطار الأم أو الأقارب بالأمراض الوراثية و/أو المعدية المكتشفة لدى الطفل، يمكن أن يساعد في حل المشكلات الأخلاقية والقانونية المتعلقة بالاستخدام السريري لخلايا دم الحبل السري.

وسيكون الشرط الأساسي لتطوير زراعة الخلايا في أوكرانيا هو اعتماد برنامج التبرع بالخلايا الجذعية الوطني وتطوير التعاون الدولي مع البلدان الأخرى من خلال جمعية المتبرعين بالنخاع العالمية (WMDA)، وبرنامج المتبرعين بالنخاع الوطني الأمريكي (NMDP) وغيرها من السجلات.

بتلخيص التاريخ القصير لتطور زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري، نلاحظ أن الافتراضات الأولى حول إمكانية استخدام دم الحبل السري في العيادات، والتي طُرحت في أوائل السبعينيات، تأكدت في الثمانينيات من خلال نتائج الدراسات التجريبية على الحيوانات. وفي عام ١٩٨٨، أُجريت أول عملية زرع خلايا مكونة للدم من دم الحبل السري في العالم لإنسان، وبعد ذلك بدأت شبكة عالمية لبنوك دم الحبل السري بالظهور. في غضون عشر سنوات، اقترب عدد المرضى الذين خضعوا لزراعة خلايا مكونة للدم من دم الحبل السري من ٨٠٠ مريض. من بينهم مرضى يعانون من أمراض مختلفة، من الأورام (سرطان الدم، والليمفوما، والأورام الصلبة) وغير الأورام (نقص المناعة الخلقي، وفقر الدم، والأمراض المرتبطة باضطرابات التمثيل الغذائي).

محتوى الخلايا الأولية والملتزمة في دم الحبل السري أعلى منه في الدم المحيطي للبالغين. من حيث عدد وحدات تكوين مستعمرات الخلايا المحببة والبلعمية وقدرتها التكاثرية، يتفوق دم الحبل السري بشكل ملحوظ على الدم المحيطي للبالغين حتى بعد إدخال عوامل النمو. في مزارع الخلايا طويلة الأمد في المختبر، لوحظ نشاط تكاثري وحيوية أكبر لخلايا دم الحبل السري مقارنةً بخلايا نخاع العظم. تشمل العوامل الحاسمة في زراعة الخلايا الجذعية لدم الحبل السري عدد الخلايا النووية وقدرتها على تكوين الدم، ووجود عدوى الفيروس المضخم للخلايا، وتوافق مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA) بين المتبرع والمتلقي، ووزن الجسم وعمر المريض.

مع ذلك، ينبغي النظر في زراعة الخلايا الجذعية من دم الحبل السري كبديل لزراعة نخاع العظم لعلاج أمراض الدم الحادة، وخاصةً لدى الأطفال. يتم تدريجيًا حل المشكلات السريرية المتعلقة بزراعة خلايا دم الحبل السري، حيث تتوفر بالفعل طرق فعالة لجمع خلايا دم الحبل السري وفصلها وحفظها بالتبريد، ويتم توفير الظروف اللازمة لإنشاء بنوك دم الحبل السري، كما يجري تحسين أساليب اختبار الخلايا النووية. يُعتبر محلول الجيلاتين 3% ومحلول نشا هيدروكسي إيثيل 6% الخيار الأمثل للفصل أثناء جمع الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري على نطاق واسع عند إنشاء البنوك.

أشار ب. بيريخريستنكو وزملاؤه (2001) بحق إلى أن زراعة خلايا دم الحبل السري الجذعية ينبغي أن تأخذ مكانها الصحيح في مجموعة التدابير العلاجية للتغلب على حالات تثبيط تكوين الدم من مختلف المنشأ، إذ تتمتع خلايا دم الحبل السري الجذعية بعدد من المزايا المهمة، من أهمها البساطة النسبية في الحصول عليها، وغياب أي خطر على المتبرع، وانخفاض تلوث خلايا حديثي الولادة بالفيروسات، وانخفاض تكلفة الزراعة نسبيًا. ويشير بعض الباحثين إلى أن زراعة خلايا دم الحبل السري أقل شيوعًا في حدوث مضاعفات مرتبطة بتفاعل الطعم مع المضيف مقارنةً بزراعة خلايا نخاع العظم، ويعود ذلك، في رأيهم، إلى ضعف التعبير عن مستضدات HLA-DR على خلايا دم الحبل السري وعدم نضجها. ومع ذلك، فإن المجموعة الرئيسية من الخلايا النووية في دم الحبل السري هي الخلايا الليمفاوية التائية (خلايا CD3 الإيجابية)، والتي يصل محتواها إلى حوالي 50٪، وهو أقل بنسبة 20٪ من تلك الموجودة في الدم المحيطي للبالغين، ولكن الاختلافات الظاهرية في مجموعات الخلايا التائية الفرعية من هذه المصادر غير ذات أهمية.

من بين العوامل المؤثرة بشكل مباشر على معدل البقاء على قيد الحياة في زراعة الخلايا الجذعية من دم الحبل السري، تجدر الإشارة إلى عمر المرضى (تُلاحظ أفضل النتائج لدى المتلقين الذين تتراوح أعمارهم بين سنة وخمس سنوات)، والتشخيص المبكر للمرض، ونوع سرطان الدم (تكون الفعالية أعلى بكثير في سرطان الدم الحاد). ومن العوامل ذات الأهمية البالغة جرعة خلايا دم الحبل السري المُنْوَاة، بالإضافة إلى توافقها مع مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA) لدى المتلقي. وليس من قبيل المصادفة أن يُظهر تحليل الفعالية السريرية لزراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم من دم الحبل السري في طب الأورام الدموية أفضل نتائج العلاج عند استخدام عمليات زرع ذات صلة: حيث تصل نسبة البقاء على قيد الحياة لمدة عام واحد دون انتكاس في هذه الحالة إلى 63%، بينما تصل في حالة الزراعة غير ذات الصلة إلى 29% فقط.

وبالتالي، فإن وجود عدد كبير من الخلايا الجذعية في دم الحبل السري والقدرة العالية على إعادة التكاثر للخلايا الجذعية المكونة للدم حديثي الولادة يسمحان باستخدامها في عمليات الزراعة الخيفية لدى مرضى الأورام الدموية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استعادة تكون الدم بعد زراعة خلايا دم الحبل السري تكون "ممتدة زمنياً": عادةً ما يُلاحظ استعادة محتوى العدلات في الدم المحيطي بنهاية الأسبوع السادس، وعادةً ما يختفي نقص الصفيحات الدموية بعد 6 أشهر. بالإضافة إلى ذلك، فإن عدم نضج خلايا دم الحبل السري المكونة للدم لا يستبعد وجود صراعات مناعية: يُلاحظ داء الطعم ضد المضيف الحاد والمزمن الشديد لدى 23% و25% من المتلقين على التوالي. تُلاحظ انتكاسات سرطان الدم الحاد بنهاية السنة الأولى بعد زراعة خلايا دم الحبل السري في 26% من الحالات.

[ 10 ]، [ 11 ]